കൊറോണ വൈറസ് റെപ്ലിക്കേഷൻ-ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ കോംപ്ലക്സ്: NSP9-ലെ സംരക്ഷിത സൈറ്റുകളിലേക്കുള്ള NiRAN-RdRp ഉപയൂണിറ്റുകളുടെ പ്രധാനപ്പെട്ടതും തിരഞ്ഞെടുക്കപ്പെട്ടതുമായ NMPylation

പീറ്റർ സാർനോ എഡിറ്റ് ചെയ്തത്, സ്റ്റാൻഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി സ്കൂൾ ഓഫ് മെഡിസിൻ, സ്റ്റാൻഫോർഡ് യൂണിവേഴ്സിറ്റി, കാലിഫോർണിയ, 2020 ഡിസംബർ 25-ന് അംഗീകരിച്ചു (2020 ഒക്ടോബർ 25-ന് അവലോകനം ചെയ്തത്)

കൊറോണ വൈറസ്-ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ കോംപ്ലക്സുകളുടെ പകർപ്പെടുക്കലിൽ ഉപയൂണിറ്റുകൾ തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു, അവ പകർത്തലിനും പരിണാമ സംരക്ഷണത്തിനും അത്യന്താപേക്ഷിതമാണ്.nsp12 മായി ബന്ധപ്പെട്ട NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന് ട്രാൻസ്‌ഫിൽ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് (NMP) ട്രാൻസ്‌ഫറസ് ആക്‌റ്റിവിറ്റി ഉണ്ടെന്നതിന് ഞങ്ങൾ തെളിവുകൾ നൽകി, കൂടാതെ അതിന്റെ ലക്ഷ്യമായി nsp9 (ആർഎൻഎ ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീൻ) തിരിച്ചറിഞ്ഞു.Mn2+ അയോണുകളെയും തൊട്ടടുത്തുള്ള സംരക്ഷിത Asn അവശിഷ്ടങ്ങളെയും ആശ്രയിക്കുന്ന ഒരു പ്രതികരണത്തിൽ, സംരക്ഷിത nsp9 അമിനോ ടെർമിനസിലേക്ക് NMP മൊയിറ്റിയുടെ കോവാലന്റ് അറ്റാച്ച്‌മെന്റിനെ NiRAN ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു.കൊറോണ വൈറസ് പകർപ്പെടുക്കുന്നതിന് NiRAN പ്രവർത്തനവും nsp9 NMPylation അനിവാര്യമാണെന്ന് കണ്ടെത്തി.ആർഎൻഎ വൈറസുകളുടെ ഒരു വിഭാഗത്തിൽ ആർഎൻഎ സിന്തസിസ് ആരംഭിക്കുന്നത് പ്രവർത്തനപരമായും പരിണാമപരമായും സ്ഥിരതയുള്ളതാണെന്ന അനുമാനത്തിലെ മുൻ നിരീക്ഷണങ്ങളുമായി നെസ്റ്റഡ് വൈറസ് എൻസൈം മാർക്കറിന്റെ ഈ പ്രവർത്തനത്തെ ബന്ധിപ്പിക്കാൻ ഡാറ്റ ഞങ്ങളെ അനുവദിക്കുന്നു.

Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, കൂടാതെ മറ്റ് 12 കുടുംബങ്ങൾ) ന്റെ RNA-ആശ്രിത RNA പോളിമറേസ് (RdRps) നിറാൻ എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന പോളിപ്രോട്ടീനിൽ നിന്ന് പുറത്തുവിടുന്ന നോൺ-സ്ട്രക്ചറൽ പ്രോട്ടീനിലെ (എൻ-ടെർമിനൽ) അമിനോ-ടെർമിനൽ (എൻ-ടെർമിനൽ) ഡൊമെയ്‌നുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. 1ab എന്നത് വൈറൽ മെയിൻ പ്രോട്ടീസ് (Mpro) ആണ്.മുമ്പ്, ആർട്ടീരിയൽ വൈറസ് NiRAN-RdRp nsp- യുടെ സ്വന്തം GMPylation/UMPylation പ്രവർത്തനം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിരുന്നു, കൂടാതെ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് (NMP) വൈറസിലേക്കും കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ സെൽ ബയോപോളിമറൈസേഷൻ കാര്യങ്ങളിലേക്കും മാറ്റുന്നതിന് ഒരു ക്ഷണികത സൃഷ്ടിക്കാൻ നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടു.ഇവിടെ, കൊറോണ വൈറസിന് (Human Coronavirus [HCoV]-229E, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ന് Mn2+-ആശ്രിത NMPylation പ്രവർത്തനം ഉണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, ഇത് Mpro-mediated nsp9-ന്റെ രൂപീകരണത്തിലൂടെ nsp9-ൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്. എൻ-ടെർമിനൽ ഫ്‌ലാങ്കിംഗ് എൻഎസ്‌പിഎസ് പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക്കായി പുറത്തിറങ്ങുന്നു, ഫോസ്‌ഫോറാമിഡേറ്റ് എൻഎസ്‌പി 9-ന്റെ എൻ-ടെർമിനലിലെ പ്രൈമറി അമിനുമായി (എൻ 3825) ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.ഈ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ യൂറിഡിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് മുൻഗണന നൽകുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡാണ്, എന്നാൽ അഡിനോസിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ്, ഗ്വാനോസിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ്, സൈറ്റിഡിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് എന്നിവയും അനുയോജ്യമായ സഹ-സബ്സ്‌ട്രേറ്റുകളാണ്.റീകോമ്പിനന്റ് കൊറോണ വൈറസ് nsp9, nsp12 പ്രോട്ടീനുകളും ജനിതകമായി എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്ത HCoV-229E മ്യൂട്ടന്റുകളും ഉപയോഗിച്ചുള്ള മ്യൂട്ടേഷൻ പഠനങ്ങൾ നിറാൻ-മെഡിയേറ്റഡ് nsp9 NMPylation നും സെൽ കൾച്ചറിലെ വൈറസ് പകർപ്പിനും ആവശ്യമായ അവശിഷ്ടങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു.ഡാറ്റ NiRAN സജീവ സൈറ്റ് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ പ്രവചനം സ്ഥിരീകരിക്കുകയും nsp9 N3826 അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ പ്രധാന പങ്ക് nsp9 NMPylation, വൈറസ് റെപ്ലിക്കേഷൻ ഇൻ വിട്രോ എന്നിവയിൽ നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു.ഈ അവശിഷ്ടം സംരക്ഷിത എൻ-ടെർമിനൽ എൻഎൻഇ ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് സീക്വൻസിന്റെ ഭാഗമാണ്, കൂടാതെ കൊറോണ വൈറസ് കുടുംബത്തിലെ nsp9 ന്റെയും അതിന്റെ ഹോമോലോഗുകളുടെയും ഒരേയൊരു മാറ്റമില്ലാത്ത അവശിഷ്ടമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടു.ഈ പഠനം മറ്റ് നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളുടെ NMPylation പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ പഠനത്തിന് ശക്തമായ അടിത്തറ നൽകുകയും ആൻറിവൈറൽ മരുന്നുകളുടെ വികസനത്തിന് സാധ്യമായ ലക്ഷ്യങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.

നിഡോവൈറൽസ് പോസിറ്റീവ് സ്ട്രാൻഡഡ് ആർഎൻഎ വൈറസ് പലതരം കശേരുക്കളെയും അകശേരുക്കളെയും ബാധിക്കുന്നു (1, 2).ഓർഡറിൽ നിലവിൽ 14 കുടുംബങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു (3), അതിൽ കൊറോണ വൈറസ് കുടുംബം കഴിഞ്ഞ 20 വർഷമായി വിപുലമായി പഠിച്ചു.അക്കാലത്ത്, മൃഗങ്ങളുടെ ആതിഥേയരിൽ നിന്ന് മൂന്ന് സൂനോട്ടിക് കൊറോണ വൈറസുകൾ ഉയർന്നുവരുകയും മനുഷ്യരിൽ കടുത്ത ശ്വാസകോശ സംബന്ധമായ അണുബാധകൾ പൊട്ടിപ്പുറപ്പെടുകയും ചെയ്തു.കഠിനമായ നിശിത പകർച്ചവ്യാധികൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന സ്ഥിരമായ പകർച്ചവ്യാധികൾ ഉൾപ്പെടെ.റെസ്പിറേറ്ററി സിൻഡ്രോം കൊറോണ വൈറസ് 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).നിഡോവൈറസുകൾ ഒരു പൊതു ജീനോം ഓർഗനൈസേഷൻ പങ്കിടുന്നു, കൂടാതെ മെംബ്രൺ-ബൗണ്ട് റെപ്ലിക്കേഷൻ-ട്രാൻസ്‌ക്രിപ്ഷൻ കോംപ്ലക്‌സിന്റെ (ആർ‌ടി‌സി) ഉപയൂണിറ്റ് 5-?²-ടെർമിനൽ മൂന്നിൽ രണ്ട് ഭാഗത്തിലും വൈറസ് കണത്തിന്റെ പ്രധാന ഘടനാപരമായ ഉപയൂണിറ്റിലും ചില അനുബന്ധ ഉപകരണങ്ങളിലും എൻകോഡ് ചെയ്‌തിരിക്കുന്നു. .പ്രോട്ടീൻ, ജീനോമിന്റെ 3??² എൻഡ് മൂന്നിൽ എൻകോഡ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു (1).പ്ലാനേറിയൻ വൈറസുകളുടെ ഒരു കുടുംബം (മോണോവിരിഡേ) (8) ഒഴികെ, എല്ലാ നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളും RTC ഉപയൂണിറ്റുകളെ രണ്ട് വലിയ ഓപ്പൺ റീഡിംഗ് ഫ്രെയിമുകളിൽ (ORF) ORF1a, ORF1b എന്നിവയിൽ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു, അവ ജീനോമിക് RNA യിൽ നിന്ന് വിവർത്തനം ചെയ്യപ്പെടുന്നു.ORF1a പോളിപ്രോട്ടീൻ (pp) 1a എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു, ORF1a, ORF1b എന്നിവ സംയുക്തമായി pp1ab എൻകോഡ് ചെയ്യുന്നു.ORF1a എൻകോഡ് ചെയ്ത പ്രധാന പ്രോട്ടീസിന്റെ (Mpro) പൊതുവായ പങ്കാളിത്തത്തോടെ, pp1a, pp1ab എന്നിവ പ്രോട്ടിയോലിറ്റിക്കലായി വിവിധ ഘടനാപരമായ പ്രോട്ടീനുകളിലേക്ക് (nsps) പ്രോസസ്സ് ചെയ്യുന്നു, ഇത് 3CLpro എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, കാരണം ഇതിന് പികോർണാവൈറസിന്റെ 3Cpro-യുമായി ഹോമോളജി ഉണ്ട് ( 9).ഈ nsps ഒരു വലിയ ഡൈനാമിക് ആർടിസിയിൽ കൂട്ടിച്ചേർക്കപ്പെട്ടതായി കരുതപ്പെടുന്നു, ജീനോമിക് ആർഎൻഎ (റെപ്ലിക്കേഷൻ), ഒരു കൂട്ടം സബ്ജെനോമിക് ആർഎൻഎ (ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ) എന്നിവയുടെ സമന്വയത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു, കൂടാതെ ORF1b യുടെ (10? ? ?12).

പ്രധാന RTC-യിൽ RNA-ആശ്രിത RNA പോളിമറേസ് (RdRp) (13), സൂപ്പർഫാമിലി 1 ഹെലിക്കേസ് (HEL1) (14, 15) കൂടാതെ നിരവധി RNA പ്രോസസ്സിംഗ് എൻസൈമുകളും ഉൾപ്പെടുന്നു, അവ പ്രധാനമായും ORF1b-യിലും കൊറോണ വൈറസ് കുടുംബത്തിലും എൻകോഡ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു, ഇതിൽ nsp12-nsp16 അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു ആർട്ടീരിയോവൈരിഡേ കുടുംബത്തിലെ nsp9-nsp12 (റഫറൻസ് 10ââ 12 കാണുക).RdRp, HEL1 എന്നിവ പക്ഷികളുടെ നെസ്റ്റ് വൈറസിന്റെ രണ്ട് (അഞ്ചിൽ ഒന്ന്) സംരക്ഷിത ഡൊമെയ്‌നുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ മറ്റ് ആർഎൻഎ വൈറസുകൾക്കിടയിൽ ഹോമോളജി ഉണ്ട്.pp1a-യുടെ കാർബോക്‌സി-ടെർമിനൽ (സി-ടെർമിനൽ) മേഖലയിൽ നിന്നും, എം‌പ്രോയുടെ താഴേയ്‌ക്ക് (യഥാക്രമം കൊറോണ വൈറസ് nsp5, ആർട്ടീരിയൽ വൈറസ് nsp4) പുറത്തുവിടുന്ന നിരവധി ചെറിയ nsps ഉൾപ്പെടെ, മറ്റ് ഉപഘടകങ്ങൾ കോർ റെപ്ലിക്കെയ്‌സിനെ സഹായിക്കുമെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു.അവർക്ക് പരിമിതമായ കുടുംബ-നിർദ്ദിഷ്‌ട പരിരക്ഷയും വൈവിധ്യമാർന്ന പ്രവർത്തനങ്ങളുമുണ്ട് (റഫറൻസ് 10ââ12-ൽ അവലോകനം ചെയ്തത്).

താരതമ്യേന അടുത്തിടെ, എല്ലാ നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളിലും ആർഡിആർപിയോട് ചേർന്നുള്ള അമിനോ ടെർമിനസിൽ (എൻ-ടെർമിനസ്) തനതായ സീക്വൻസ് മോട്ടിഫ് സ്വഭാവസവിശേഷതകളുള്ള ഒരു ഡൊമെയ്‌ൻ കണ്ടെത്തി, എന്നാൽ മറ്റ് ആർഎൻഎ വൈറസുകളൊന്നുമില്ല (16).അതിന്റെ സ്ഥാനവും ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ട്രാൻസ്ഫറസ് (ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് [NMP] ട്രാൻസ്ഫറസ്) പ്രവർത്തനവും അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഈ ഡൊമെയ്‌നിന് NiRAN (Nestvirus RdRp- റിലേറ്റഡ് ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് ട്രാൻസ്ഫറസ്) എന്ന് പേരിട്ടു.NiRAN-RdRp-ന്റെ ഇരട്ട-ഡൊമെയ്‌ൻ സംയോജനം കൊറോണവൈറിഡേ കുടുംബത്തിൽ nsp12 ഉം Arterioviridae കുടുംബത്തിൽ nsp9 ഉം, മറ്റ് നെസ്റ്റോവിരിഡേകളിൽ, NiRAN-RdRp വൈറൽ പോളിപ്രോട്ടീനിൽ നിന്ന് ഒരു സ്വതന്ത്ര nsp ആയി പുറത്തിറങ്ങുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.കൊറോണ വൈറസിൽ, NiRAN ഡൊമെയ്‌നിൽ ??1/450 അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു കൂടാതെ ലിങ്കർ റീജിയൻ വഴി C-ടെർമിനൽ RdRp ഡൊമെയ്‌നുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു (16.19).Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), recombinant nsp9 കാണിക്കുന്നത് Mn2+ അയൺ-ആശ്രിത (സ്വയം) UMPylation, GMPylation പ്രവർത്തനങ്ങൾ, നെസ്റ്റോവൈറസ്, AN, BN, CN എന്നിവയിലെ മൂന്ന് സംരക്ഷിത സീക്വൻസ് ബേസുകളെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.എവിടെ N എന്നാൽ NiRAN) (16).ഈ മോട്ടിഫുകളുടെ N-ടെർമിനൽ ഫ്ലാങ്കിംഗ് കുറഞ്ഞ യാഥാസ്ഥിതിക മോട്ടിഫ് preAN ആണ്.ഈ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ചിലത് വിദൂര ബന്ധമുള്ള പ്രോട്ടീൻ കൈനസുകളിലും സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, അവിടെ അവ ന്യൂക്ലിയോസൈഡ് ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് (NTP) ബൈൻഡിംഗിലും കാറ്റലറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തിലും ഉൾപ്പെട്ടതായി കാണിക്കുന്നു (20, 21).ഈ നിരീക്ഷണത്തിന് അനുസൃതമായി, അടുത്തിടെ പ്രസിദ്ധീകരിച്ച SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 സൂപ്പർ കോംപ്ലക്‌സ് ഉപയോഗിച്ച് സ്യൂഡോമോണസ് സിറിഞ്ചെയിൽ നിന്നുള്ള സ്യൂഡോകിനേസ് സെലോയിലെ സജീവമായ നിരവധി സൈറ്റുകളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ കൂട്ടിച്ചേർക്കാവുന്നതാണ്.സംരക്ഷിത കൊറോണ വൈറസ് NiRAN അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഇലക്ട്രോൺ മൈക്രോസ്ട്രക്ചറിൽ സൂപ്പർഇമ്പോസ് ചെയ്തു.റീകോമ്പിനന്റ് പ്രോട്ടീൻ (17).ഡോക്യുമെന്റഡ് (സ്വയം) U/GMPylation എൻഎംപിയെ (നിലവിൽ അജ്ഞാതമായ) സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിലേക്ക് (16) കൈമാറാൻ ഒരു ക്ഷണികമായ അവസ്ഥ ഉണ്ടാക്കുമെന്ന് ഊഹിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ NiRAN ഉം പ്രോട്ടീൻ കൈനസും തമ്മിലുള്ള ഘടനാപരമായ സാമ്യം (17, 19) ) ഇതാണ് അനുമാനം NiRAN മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളെ പരിഷ്കരിക്കുന്നു.

നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളുമായുള്ള അതിന്റെ അതുല്യവും അതുല്യവുമായ വ്യവസ്ഥാപിത ബന്ധവും RdRp-യിൽ നിന്നുള്ള ജനിതക വേർതിരിവും ഉൾപ്പെടെ നിരവധി സവിശേഷതകൾ, നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകൾക്കുള്ള ന്യായമായ കീ റെഗുലേറ്ററി എൻസൈമായി NiRAN-നെ മാറ്റുന്നു, ഇത് അവയുടെ ആവിർഭാവത്തിനും സ്വത്വത്തിനും നിർണ്ണായകമാണ്.മുമ്പ്, ജീനോം/സബ്ജെനോമിക് വിവർത്തനം അല്ലെങ്കിൽ റെപ്ലിക്കേഷൻ/ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ എന്നിവ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് നിറാൻ ഉൾപ്പെടുന്ന മൂന്ന് സാധ്യമായ പ്രവർത്തനങ്ങൾ വിളിച്ചിരുന്നു.അക്കാലത്ത് ലഭ്യമായ അപൂർവവും അപൂർണ്ണവുമായ ഡാറ്റ പരിഗണിക്കുമ്പോൾ, ഓരോ ഫംഗ്ഷനും അതിന്റെ ഗുണങ്ങളും ദോഷങ്ങളുമുണ്ട് (16).ഈ ഗവേഷണത്തിൽ, രണ്ട് ജനുസ്സുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന കൊറോണ വൈറസുകളുടെ ബയോകെമിക്കൽ, റിവേഴ്‌സ് ജനിതക പഠനങ്ങൾ സംയോജിപ്പിക്കാനും കൊറോണ വൈറസ് കുടുംബത്തിന്റെ സ്വാഭാവിക പരിവർത്തനത്തിന്റെ പരിണാമ പശ്ചാത്തലത്തിൽ ഞങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലുകൾ സ്ഥാപിക്കാനും ഞങ്ങൾ ലക്ഷ്യമിടുന്നു.ആർ‌ടി‌സിയിലെ സ്വാഭാവിക ലക്ഷ്യങ്ങൾ തിരിച്ചറിയുന്നതിലൂടെ നിറാൻ മനസ്സിലാക്കുന്നതിലെ പ്രധാന പുരോഗതി ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു, ഇത് (ലഭ്യമായ മൂന്ന് സിദ്ധാന്തങ്ങളിൽ) നെസ്റ്റഡ് വൈറസ് ആർ‌എൻ‌എയുടെ സമന്വയം ആരംഭിക്കുന്നതിൽ ഈ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ പങ്ക് സംഭാവന ചെയ്യുന്നു.വൈറസ് ഹോസ്റ്റ് ഇന്റർഫേസിൽ NiRAN-ന്റെ മറ്റ് റോളുകൾക്കുള്ള സാധ്യതകളും ഈ ഗവേഷണം തുറക്കുന്നു.

കൊറോണ വൈറസ് nsp12-മായി ബന്ധപ്പെട്ട NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന്റെ എൻസൈമാറ്റിക് ഗുണങ്ങളെ ചിത്രീകരിക്കുന്നതിനായി, C-ടെർമിനസിൽ His6 ടാഗ് സഹിതം, E. coli-ൽ ഞങ്ങൾ ഹ്യൂമൻ കൊറോണ വൈറസ് 229E (HCoV-229E) nsp12-ന്റെ ഒരു പുനഃസംയോജന രൂപം നിർമ്മിച്ചു. [α32-P ] ഉള്ള പ്രോട്ടീൻ, മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ MnCl2 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ NTP യോടൊപ്പം ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.പ്രതികരണ ഉൽപ്പന്നത്തിന്റെ വിശകലനം, nsp12 (106 kDa) യുമായി സഹകരിച്ച് മൈഗ്രേറ്റുചെയ്യുന്ന റേഡിയോലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീന്റെ സാന്നിധ്യം സൂചിപ്പിച്ചു, കൊറോണ വൈറസ് nsp12, യൂറിഡിൻ മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് (UMP) ഉപയോഗിച്ച് രൂപപ്പെട്ട കോവാലന്റ് പ്രോട്ടീൻ-NMP അഡക്‌റ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 1A) ബി).മറ്റ് ന്യൂക്ലിയോടൈഡുകളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, UMP സംയോജനത്തിന്റെ സിഗ്നൽ തീവ്രത 2 മുതൽ 3 മടങ്ങ് വരെ വർദ്ധിച്ചതായി ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് വിശകലനം കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 1C).ഈ ഡാറ്റ കൊറോണ വൈറസിന്റെ (16) NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന്റെ പ്രവചിക്കപ്പെട്ട NMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ കൊറോണ വൈറസിന്റെയും ആർട്ടീരിയൽ വൈറസിന്റെയും NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് മുൻഗണനകൾ വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

HCoV-229E nsp12-ന്റെ സ്വയം-NMPylation പ്രവർത്തനം.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) നിയുക്ത [α-32P] NTP ഉപയോഗിച്ച് 6 mM MnCl2 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ 30 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു (വിശദാംശങ്ങൾക്ക് മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും കാണുക).പ്രതികരണ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ SDS-PAGE ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിക്കുകയും Coomassie ബ്രില്യന്റ് ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.(ബി) റേഡിയോ ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീൻ ഫോസ്ഫറസ് ഇമേജിംഗ് വഴി ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നു.nsp12-His6, പ്രോട്ടീൻ മോളിക്യുലാർ മാസ് മാർക്കറുകൾ (കിലോഡാൽട്ടണുകളിൽ) എന്നിവയുടെ സ്ഥാനങ്ങൾ A, B എന്നിവയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.*P≤0.05.സിഗ്നൽ ശക്തി (ശതമാനം) യുടിപിയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.

സെൽ കൾച്ചറിൽ (16) EAV, SARS-CoV എന്നിവയുടെ അനുകരണത്തിന് NiRAN-മായി ബന്ധപ്പെട്ട എൻസൈം പ്രവർത്തനങ്ങൾ അനിവാര്യമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, നിർദ്ദിഷ്ട NiRAN പ്രവർത്തനവും സാധ്യതയുള്ള ലക്ഷ്യങ്ങളും ഇതുവരെ നിർണ്ണയിച്ചിട്ടില്ല.NiRAN ഉം പ്രോട്ടീൻ കൈനാസ് പോലെയുള്ള മടക്കുകളുള്ള പ്രോട്ടീനുകളുടെ ഒരു കുടുംബവും തമ്മിൽ അടുത്തിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ട ഘടനാപരമായ സാമ്യം (17, 22) NiRAN മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ NMPylation ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു എന്ന അനുമാനം പരിശോധിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു.HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) എൻകോഡ് ചെയ്‌ത നോൺ-സ്ട്രക്ചറൽ പ്രോട്ടീനുകൾ ഉൾപ്പെടെ, ഓരോന്നിനും C-ടെർമിനൽ His6 ടാഗ് (SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1) അടങ്ങുന്ന, സാധ്യതയുള്ള ഹോമോലോഗസ് ടാർഗെറ്റുകളുടെ ഒരു കൂട്ടം ഞങ്ങൾ സൃഷ്‌ടിച്ചു. nsp12 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ ഈ പ്രോട്ടീനുകളെ [α32-P] യൂറിഡിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് ([α32-P]UTP) ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.ഇ.കോളിയിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന ബോവിൻ സെറം ആൽബുമിനും MBP-LacZα ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനും നിയന്ത്രണങ്ങളായി വർത്തിച്ചു (ചിത്രം 2A, പാതകൾ 1 മുതൽ 7 വരെ).റേഡിയോ ലേബൽ ചെയ്‌ത പ്രോട്ടീൻ സോഡിയം ഡോഡെസിൽ സൾഫേറ്റ്-പോൾയാക്രിലമൈഡ് ജെൽ ഇലക്‌ട്രോഫോറെസിസ് (SDS-PAGE), ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫി എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു, nsp12, nsp9 എന്നിവ അടങ്ങിയ പ്രതികരണത്തിൽ ശക്തമായ റേഡിയോ ആക്ടീവ് സിഗ്നൽ ഉണ്ടെന്ന് കണ്ടെത്തി.സിഗ്നലിന്റെ സ്ഥാനം nsp9 ന്റെ തന്മാത്രാ പിണ്ഡവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് nsp9-ന്റെ nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് UMPylation സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 2B, ട്രാക്ക് 7).മറ്റ് ടെസ്റ്റ് പ്രോട്ടീനുകളൊന്നും UMPylated ആണെന്ന് കണ്ടെത്തിയില്ല, ഇത് nsp9 nsp12 ന്റെ ഒരു പ്രത്യേക അടിവസ്ത്രമാണെന്ന നിഗമനത്തിലേക്ക് ഞങ്ങളെ നയിച്ചു.ചിത്രം 1-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന സ്വയം-NMPylation ഡാറ്റയ്ക്ക് അനുസൃതമായി, nsp12-ന് നാല് NMP-കളും nsp9-ലേക്ക് കൈമാറാൻ കഴിയും, കാര്യക്ഷമത വ്യത്യസ്തമാണെങ്കിലും, UMP> അഡെനോസിൻ മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് (AMP)> ഗ്വാനോസിൻ മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് (GMP)> സൈറ്റിഡിൻ മോണോഫോസ്ഫേറ്റ് (CMP) ) ( ചിത്രം).3 എയും ബിയും).ഈ വിശകലനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന വ്യവസ്ഥകൾക്ക് കീഴിൽ (പ്രതികരണവും എക്സ്പോഷർ സമയവും ചുരുക്കുക, nsp12 ന്റെ സാന്ദ്രത കുറയ്ക്കുക; മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും), nsp12-ന്റെ സ്വയം-NMPylation കണ്ടുപിടിക്കാൻ കഴിഞ്ഞില്ല (ചിത്രം 2B, ലെയ്ൻ 7, ചിത്രം 1B എന്നിവ താരതമ്യം ചെയ്യുക). ഫലപ്രദമായ (ഒപ്പം ഒന്നിലധികം റൗണ്ടുകൾ) UMP nsp12 ൽ നിന്ന് nsp9 ലേക്ക് മാറ്റി.UMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനത്തിന് ചിത്രം 3C-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ Mn2+ അയോണുകളുടെ സാന്നിധ്യം ആവശ്യമാണ്, അതേസമയം Mg2+ ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ഏറ്റവും കുറഞ്ഞ UMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനം മാത്രമേ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടിട്ടുള്ളൂ, കൂടാതെ പരീക്ഷിച്ച മറ്റ് രണ്ട് ഡൈവാലന്റ് കാറ്റേഷനുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ പ്രവർത്തനമൊന്നുമില്ല.സൈറ്റിഡിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് (സിടിപി), ഗ്വാനോസിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് (ജിടിപി), അഡെനോസിൻ ട്രൈഫോസ്ഫേറ്റ് (എടിപി) (എസ്ഐ അനുബന്ധം, ചിത്രം എസ് 1) എന്നിവ അടങ്ങിയ എൻഎംപിലേഷൻ പരിശോധനകളിൽ സമാനമായ ഡാറ്റ ലഭിച്ചു.

nsp9-ന്റെ HCoV-229E nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് UMPylation.HCoV-229E nsp12-Hisdiated-ന്റെ UMPylation പ്രവർത്തനം വിലയിരുത്താൻ പ്രോട്ടീൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളുടെ ഒരു ശ്രേണി (ബോവിൻ സെറം ആൽബുമിൻ, MBP-lacZα, കൂടാതെ ORF1a എൻകോഡ് ചെയ്‌ത C-ടെർമിനൽ His6 എന്ന് ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന HCoV-229E nsps എന്നിവയുൾപ്പെടെ) ഉപയോഗിച്ചു. പ്രോട്ടീൻ.മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ nsp12 ന്റെ അഭാവത്തിൽ (A) അല്ലെങ്കിൽ സാന്നിധ്യത്തിൽ (B) 10 മിനിറ്റ് [α-32P] UTP ഉപയോഗിച്ച് പ്രോട്ടീൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക.A, B എന്നിവയുടെ മുകളിൽ, Coomassie Brilliant Blue നിറമുള്ള SDS-polyacrylamide ജെൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, A, B എന്നിവയുടെ ചുവടെ, അനുബന്ധ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാമുകൾ കാണിക്കുന്നു.പ്രോട്ടീൻ തന്മാത്രാ മാസ് മാർക്കറിന്റെ സ്ഥാനം (കിലോഡാൽട്ടണുകളിൽ) ഇടതുവശത്ത് നൽകിയിരിക്കുന്നു.nsp12-His6 (B, top) ന്റെ സ്ഥാനവും nsp9-His6 (B, ലെയ്ൻ 7) ഉള്ള nsp12-His6 ഇൻകുബേഷൻ സമയത്ത് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ട റേഡിയോ ആക്ടീവ് സിഗ്നലും സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു, ഇത് [α-32P]UMP മുതൽ nsp9-His6 വരെ (12.9 kDa), പരിശോധിച്ച മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് ഇത് നിരീക്ഷിച്ചിട്ടില്ല.

nsp9 NMPylation-ന്റെ HCoV-229E NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് ബയോകെമിക്കൽ, വൈറോളജിക്കൽ സ്വഭാവം.(എ, ബി) പ്രതികരണത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് കോ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിന്റെ പങ്ക്.Nsp12-His6, nsp9-His6 എന്നിവ വ്യത്യസ്ത [α-32P] NTP-കളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ സാധാരണ NMPylation അസെയിൽ മിക്സഡ് ചെയ്യുകയും ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.(എ, മുകളിൽ) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE കൊണ്ട് വേർതിരിച്ചിരിക്കുന്നു.(എ, താഴെ) ജെല്ലിന്റെ അതേ പ്രദേശത്തിന്റെ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫ്.(ബി) നിയുക്ത ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് കോഫാക്ടറിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ആപേക്ഷിക പ്രവർത്തനം (അർത്ഥം ± SEM) മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെടുന്നു.*P≤0.05.(സി) ലോഹ അയോണുകളുടെ പങ്ക്.[α-32P] UTP യുടെയും വ്യത്യസ്ത ലോഹ അയോണുകളുടെയും സാന്നിധ്യത്തിലുള്ള സ്റ്റാൻഡേർഡ് NMPylation പരിശോധനയാണ് കാണിക്കുന്നത്, ഓരോന്നിനും 1 mM സാന്ദ്രതയുണ്ട്.C-യിൽ, മുകളിൽ, Coomassie സ്റ്റെയിൻഡ് nsp9-His6 കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ C-ൽ താഴെ, അനുബന്ധ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫി കാണിക്കുന്നു.ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന പ്രോട്ടീന്റെ വലുപ്പം (കിലോഡാൽട്ടണിൽ) A, C എന്നിവയുടെ ഇടതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. (D) HCoV-229E nsp12-His6 ന്റെ പരിവർത്തന രൂപം, വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, [α-32P]UTP-ലാണ്. മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും.എൻ‌എം‌പിലേഷൻ പ്രതികരണത്തിൽ ഉൽ‌പാദിപ്പിക്കുന്ന റേഡിയോ ലേബൽ‌ ചെയ്‌ത nsp9-His6 ഫോസ്‌ഫോറിലേഷൻ ഇമേജിംഗ് (ഡി, ടോപ്പ്) വഴി കണ്ടെത്തുന്നു.വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (wt) പ്രോട്ടീനുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ആപേക്ഷിക പ്രവർത്തനം ഡിയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് അടിഭാഗം ശരാശരി (±SEM) ആയി കണക്കാക്കുന്നു.സംരക്ഷിക്കപ്പെടാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ പകരക്കാരെ നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.(E) അണുബാധയ്ക്ക് 24 മണിക്കൂറിന് ശേഷം ലഭിച്ച p1 കോശങ്ങളുടെ കൾച്ചർ സൂപ്പർനാറ്റന്റിലുള്ള വൈറസ് ടൈറ്റർ പ്ലാക്ക് അസ്സേ വഴി നിർണ്ണയിച്ചു.എഞ്ചിനീയറിംഗ് HCoV-229E മ്യൂട്ടന്റിൻറെ NiRAN ഡൊമെയ്‌നിലെ കോഡൺ സബ്‌സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു (അവശിഷ്ട നമ്പറിംഗ് pp1ab-ലെ അവയുടെ സ്ഥാനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ളതാണ്).റെപ്ലിക്കേഷൻ-ഡിഫിഷ്യന്റ് RdRp സജീവ സൈറ്റ് മ്യൂട്ടന്റ് nsp12_DD4823/4AA ഒരു നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു.

NiRAN-ന്റെ സജീവ സൈറ്റിനെക്കുറിച്ച് ആഴത്തിലുള്ള ധാരണ നേടുന്നതിനും nsp9- സ്പെസിഫിക് NMP ട്രാൻസ്ഫറസിന്റെ പ്രവർത്തനവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അവശിഷ്ടങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കുന്നതിനും, ഞങ്ങൾ മ്യൂട്ടേഷൻ വിശകലനം നടത്തി, അതിൽ ഞങ്ങൾ NiRAN AN, BN, CN മോട്ടിഫുകളിലെ യാഥാസ്ഥിതിക അവശിഷ്ടങ്ങൾ മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു ( 16) ഇത് അലയാണ് (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S2).കൂടാതെ, യാഥാസ്ഥിതിക Arg-to-Lys അല്ലെങ്കിൽ Lys-to-Arg പകരക്കാരുടെ സ്വാധീനം രണ്ട് കേസുകളിൽ വിലയിരുത്തി.ഒരു (നെഗറ്റീവ്) നിയന്ത്രണം എന്ന നിലയിൽ, കൊറോണ വൈറസുകളുടെയും മറ്റ് നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളുടെയും NiRAN ഡൊമെയ്‌നിൽ സംരക്ഷിക്കപ്പെടാത്തതോ കുറവോ ആയ അവശിഷ്ടങ്ങൾ Ala ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നു. BN), D4280A (CN) എന്നിവ nsp12 വഴി nsp9 NMPylation ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുകയോ ഇല്ലാതാക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു, അതേസമയം യാഥാസ്ഥിതിക സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകളുള്ള (R4178K), K4116R) പ്രോട്ടീനുകൾ അവയുടെ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ 60% ഉം 80% ഉം നിലനിർത്തുന്നു, ഇത് അതാത് ഭാഗത്തെ നിയന്ത്രണങ്ങളിൽ ഇളവ് വരുത്തുന്നു ചങ്ങലകൾ ഭൗതിക രാസപരമായി സെൻസിറ്റീവ് ആണ് (ചിത്രം 3D).മറ്റ് പല സംരക്ഷിത അവശിഷ്ടങ്ങൾ E4145A, D4273A, F4281A, D4283A എന്നിവ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നത് ദോഷകരമല്ല, കൂടാതെ nsp9 UMPylation മിതമായ അളവിൽ മാത്രമേ കുറയുകയുള്ളൂ.മറ്റ് NTP-കൾ (ചിത്രം 3D, SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S3) ഉൾപ്പെടുന്ന nsp9 NMPylation പ്രതികരണങ്ങളിൽ സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു, നിർദ്ദിഷ്ട അമിനോ ആസിഡ് പകരക്കാരിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന ഇഫക്റ്റുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡ് കോ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിന്റെ തരത്തിൽ നിന്ന് സ്വതന്ത്രമാണെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.അടുത്തതായി, സെൽ കൾച്ചറിലെ കൊറോണ വൈറസുകളുടെ പുനർനിർമ്മാണത്തിൽ ഈ nsp12 പകരക്കാരുടെ സാധ്യമായ സ്വാധീനം ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു.ഇതിനായി, 5 -7 സെല്ലുകൾ ട്രാൻസ്‌ക്രൈബുചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ റീകോമ്പിനന്റ് വാക്‌സീനിയ വൈറസിൽ (23, 24) ക്ലോൺ ചെയ്‌ത ഉചിതമായ ജനിതക എഞ്ചിനീയറിംഗ് കോംപ്ലിമെന്ററി ഡിഎൻഎ (സിഡിഎൻഎ) ടെംപ്ലേറ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു.ഈ കോശങ്ങളിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന സാംക്രമിക വൈറസ് സന്തതികളുടെ ടൈറ്ററേഷൻ കാണിക്കുന്നത് മിക്ക HCoV-229E NiRAN മ്യൂട്ടന്റുകളും പ്രായോഗികമല്ലെന്ന് (ചിത്രം 3E).പ്രവർത്തനക്ഷമമല്ലാത്ത വൈറൽ മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ ഒരു കൂട്ടം വിട്രോയിലെ NMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനം ഇല്ലാതാക്കുന്നതിനോ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുന്നതിനോ ഉള്ള ഇതരമാർഗങ്ങൾ ഉൾപ്പെടുന്നു (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), എന്നാൽ മറ്റ് രണ്ട് ഇതരമാർഗങ്ങളുണ്ട് (K4116R, E41045A) % സംവരണം ചെയ്തിട്ടുണ്ടോ?അവരുടെ ഇൻ വിട്രോ എൻഎംപിലേഷൻ പ്രവർത്തനം കൂടുതൽ നിയന്ത്രണങ്ങൾ ഉൾപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.അതുപോലെ, മറ്റ് രണ്ട് മ്യൂട്ടേഷനുകൾ (R4178K, F4281A) NiRAN-ന്റെ ഇൻ വിട്രോ NMPylation പ്രവർത്തനത്തിൽ മിതമായ കുറവിന് കാരണമായി, തത്സമയ വൈറസുകൾ ഉത്പാദിപ്പിച്ചു, എന്നിരുന്നാലും, ഈ വൈറസുകൾ പകർപ്പെടുക്കലിലൂടെ ടൈറ്ററുകൾ ഗണ്യമായി കുറയ്ക്കുന്നു.ചിത്രം 3D-യിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഇൻ വിട്രോ ആക്‌റ്റിവിറ്റി ഡാറ്റയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൊറോണ വൈറസ് കൂടാതെ/അല്ലെങ്കിൽ മറ്റ് നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളിൽ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) സംരക്ഷിക്കപ്പെടാത്ത മറ്റ് നാല് അവശിഷ്ടങ്ങൾ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നു (8, 16) സന്താനങ്ങൾ ഉണ്ടായിട്ടും പ്രായോഗിക വൈറസുകൾ ഉത്പാദിപ്പിച്ചു. വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് വൈറസുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മിതമായ അളവിൽ കുറഞ്ഞ ടൈറ്റർ (ചിത്രം 3E).

NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് NMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനം സജീവമായ RdRp ഡൊമെയ്‌നിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പഠിക്കാൻ, RdRp മോട്ടിഫ് C-യിലെ ഡൈവാലന്റ് മെറ്റൽ അയോണുകളുടെ (11) ഏകോപനത്തിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന രണ്ട് സംരക്ഷിത Asp അവശിഷ്ടങ്ങൾ Ala ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു. തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പ്രോട്ടീൻ nsp12_DD4823/4AA നിലനിർത്തുന്നു. അതിന്റെ nsp9 NMPylation പ്രവർത്തനം, nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation പ്രവർത്തനത്തിന് പോളിമറേസ് പ്രവർത്തനം ആവശ്യമില്ല (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S4).

nsp12-നുള്ള nsp9-നിർദ്ദിഷ്‌ട NMP ട്രാൻസ്‌ഫറസ് ആക്‌റ്റിവിറ്റി സ്ഥാപിച്ച ശേഷം, NMP-nsp9 ആഡക്‌ടിനെ മാസ് സ്‌പെക്‌ട്രോമെട്രി (MS) മുഖേന ചിത്രീകരിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശ്രമിച്ചു.റീകോമ്പിനന്റ് HCoV-229E nsp9-ന്റെ സമ്പൂർണ്ണ പ്രോട്ടീൻ മാസ് സ്പെക്‌ട്രം 12,045 Da എന്ന കൊടുമുടി കാണിച്ചു (ചിത്രം 4A).nsp12 ന്റെ കൂട്ടിച്ചേർക്കൽ nsp9-ന്റെ ഗുണനിലവാരത്തിൽ മാറ്റം വരുത്തിയില്ല, ഉപയോഗിച്ച വ്യവസ്ഥകൾക്ക് കീഴിൽ nsp12 ഉം nsp9 ഉം ഒരു സ്ഥിരതയുള്ള സമുച്ചയം ഉണ്ടാക്കില്ല എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 4A).UTP, GTP എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, യഥാക്രമം nsp9, nsp12 എന്നിവ അടങ്ങിയ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിന്റെ പിണ്ഡം അളക്കുന്നത് UTP യുടെ പ്രോട്ടീൻ പിണ്ഡം 306 Da ചലിച്ചതായും GTP യുടെ പ്രോട്ടീൻ പിണ്ഡം 345 Da നീങ്ങിയതായും കാണിക്കുന്നു, ഇത് ഓരോ nsp9 തന്മാത്രയും ഒരു UMP അല്ലെങ്കിൽ GMP യെ ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. (ചിത്രം 4) സി, ഡി).NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് nsp9 NMPylation-ന് ആവശ്യമായ ഊർജ്ജം NTP ജലവിശ്ലേഷണത്തിൽ നിന്നും പൈറോഫോസ്ഫേറ്റ് റിലീസിൽ നിന്നും വരുന്നതായി ഊഹിക്കപ്പെടുന്നു.ഈ പ്രതികരണത്തിൽ nsp12 (എൻസൈം) എന്നതിനേക്കാൾ 10 മടങ്ങ് മോളാർ അധികമായി nsp9 (ലക്ഷ്യം) ഉപയോഗിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, nsp9 ന്റെ ഏതാണ്ട് പൂർണ്ണമായ NMPylation നിരീക്ഷിച്ചു, nsp12 ഉം nsp9 ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രതിപ്രവർത്തനം ഹ്രസ്വകാലമാണെന്നും nsp12 ന് NMP9 കൂടുതൽ NMPylate ചെയ്യാമെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഇൻ വിട്രോ തന്മാത്ര.

nsp12, UTP അല്ലെങ്കിൽ GTP എന്നിവയുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ nsp9-ന്റെ ഒറ്റ NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1) (എഡി) യുടെ വിഘടിപ്പിച്ച സമ്പൂർണ്ണ പ്രോട്ടീൻ മാസ് സ്പെക്ട്രം കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.(A) nsp9 മാത്രം, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ.

nsp12 വഴി UMPylated nsp9 അവശിഷ്ടങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ, nsp9-UMP ട്രൈപ്സിൻ ഉപയോഗിച്ച് പിളർന്നു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന പെപ്റ്റൈഡുകളെ നാനോ-ഹൈ പെർഫോമൻസ് ലിക്വിഡ് ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി (HPLC) ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിക്കുകയും ടാൻഡം മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (MS/MS) ഓൺലൈനിൽ വിശകലനം ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ബയോണിക് സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ പാക്കേജ് (പ്രോട്ടീൻ മെട്രിക്‌സ്) ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഡാറ്റ വിശകലനം എൻ-ടെർമിനൽ അമിനോ ആസിഡിന്റെ യുഎംപിലേഷൻ കാണിച്ചു.ഇത് സ്വമേധയാ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.മുൻഗാമി പെപ്‌റ്റൈഡിന്റെ [UMP]NNEIMPGK (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5A) ന്റെ ടാൻഡം മാസ് സ്പെക്‌ട്രം 421 m/z-ൽ ഒരു ശകലം വെളിപ്പെടുത്തി, UMP nsp9-ന്റെ അവശിഷ്ടം 1-ലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനസിൽ, ഓർത്തോകൊറോണവൈറിനയിലെ അംഗങ്ങൾക്കിടയിൽ Asn സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S6).N-ടെർമിനൽ പ്രൈമറി അമിൻ നൈട്രജനാണ് UMP-യുടെ ഏറ്റവും സാധ്യതയുള്ള സ്വീകാര്യത എന്ന് ഞങ്ങൾ വിശ്വസിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, N-ടെർമിനലിൽ NMP ബൈൻഡിംഗിന്റെ അധിക തെളിവുകൾ നേടാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു.ഇക്കാരണത്താൽ, എച്ച്പിഎൽസി ശുദ്ധീകരിച്ച നോൺ-എൻഎംപിലേറ്റഡ്, എൻഎംപിലേറ്റഡ് എൻ-ടെർമിനൽ പെപ്റ്റൈഡ് nsp9 അസെറ്റോണിന്റെയും സോഡിയം സയനോബോറോഹൈഡ്രൈഡിന്റെയും സാന്നിധ്യത്തിൽ ഉരുത്തിരിഞ്ഞതാണ്.ഈ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, സ്വതന്ത്ര പ്രാഥമിക അമിനുകൾ മാത്രമേ പ്രൊപൈൽ (25) ഉപയോഗിച്ച് പരിഷ്കരിക്കാൻ കഴിയൂ.NNEIMPGK എന്ന ക്രമത്തിലുള്ള N-ടെർമിനൽ nsp9-ഉണ്ടാക്കിയ പെപ്റ്റൈഡിൽ രണ്ട് പ്രാഥമിക അമിനുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഒന്ന് Asn-ന്റെ N-ടെർമിനസിലും മറ്റൊന്ന് C-ടെർമിനസിലെ Lys-ന്റെ സൈഡ് ചെയിനിലും.അതിനാൽ, രണ്ട് അറ്റത്തും പ്രൊപൈൽ ഗ്രൂപ്പുകൾ അവതരിപ്പിക്കാവുന്നതാണ്.NMPylated അല്ലാത്ത പെപ്റ്റൈഡുകളുടെ വേർതിരിച്ചെടുത്ത അയോൺ ക്രോമാറ്റോഗ്രാമുകൾ SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5B-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, എൻ-ടെർമിനൽ, സി-ടെർമിനൽ (മോണോ) പ്രൊപ്പൈലേറ്റഡ് (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5B, അപ്പർ ലെയ്ൻ), ഡിപ്രോപിലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5B, ലോവർ ലെയ്ൻ) എന്നിവ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയും.nsp9-ന്റെ NMPylated N-terminal peptide ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ ഈ പാറ്റേൺ മാറുന്നു.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, സി-ടെർമിനൽ പ്രൊപ്പൈലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകൾ മാത്രമേ തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയൂ, എന്നാൽ എൻ-ടെർമിനൽ പ്രൊപ്പിലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളും ഡിപ്രൊപിലേറ്റഡ് പെപ്റ്റൈഡുകളും തിരിച്ചറിയാൻ കഴിയില്ല (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5C), ഇത് തടയാൻ UMP എൻ-ടെർമിനൽ പ്രൈമറി അമിനിലേക്ക് മാറ്റിയതായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു. മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തുന്നതിൽ നിന്ന് ഗ്രൂപ്പ്.

അടുത്തതായി, ടാർഗെറ്റ്-നിർദ്ദിഷ്‌ട നിയന്ത്രണങ്ങൾ നിർവചിക്കുന്നതിന് nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനസിലെ സംരക്ഷിത അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഞങ്ങൾ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നു (Ala അല്ലെങ്കിൽ Ser ഉപയോഗിച്ച്) അല്ലെങ്കിൽ ഇല്ലാതാക്കുന്നു.nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ പ്രാഥമിക അമിൻ ഉപയോഗിച്ച് NiRAN ഒരു nsp9-NMP അഡക്റ്റ് ഉണ്ടാക്കുന്നുവെന്ന് കാണിക്കുന്ന ഞങ്ങളുടെ MS ഡാറ്റയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, nsp9 NMPylation-ന് nsp9 N-ടെർമിനൽ റിലീസ് ചെയ്യാൻ വൈറൽ മാസ്റ്റർ പ്രോട്ടീസ് (Mpro, nsp5) ആവശ്യമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു. അതിന്റെ പോളിപ്രോട്ടീൻ മുൻഗാമി.ഈ സിദ്ധാന്തം പരിശോധിക്കുന്നതിനായി, ഞങ്ങൾ E. coli-ൽ nsp9 അടങ്ങിയ ഒരു മുൻഗാമി പ്രോട്ടീൻ nsp7-11 നിർമ്മിക്കുകയും [α-32P] UTP (മെറ്റീരിയലുകളും രീതികളും) സാന്നിധ്യത്തിൽ ഒരു സാധാരണ NMPylation ടെസ്റ്റ് നടത്തുകയും ചെയ്തു.ചിത്രം 5A (ലെയ്ൻ 3) ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, അൺകട്ട് nsp7-11 മുൻഗാമി nsp12 ഉപയോഗിച്ച് റേഡിയോ ലേബൽ ചെയ്തിട്ടില്ല.ഇതിനു വിപരീതമായി, മുൻഗാമിയിൽ നിന്ന് nsp9 (മറ്റ് nsps) പുറത്തുവിടാൻ nsp7-11 റീകോമ്പിനന്റ് nsp5 വഴി പിളർന്നാൽ, nsp9-നൊപ്പം മൈഗ്രേറ്റ് ചെയ്യുന്ന ഒരു റേഡിയോ ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീൻ കണ്ടെത്തി, NiRAN ഉം N- കോവാലന്റ് nsp9-NMP അഡക്റ്റുകളുടെ സെലക്ടീവ് രൂപീകരണവും ഞങ്ങളുടെ നിഗമനത്തെ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. .എൻ-ടെർമിനൽ Asn-ന്റെ ടെർമിനൽ പ്രൈമറി അമിൻ (pp1a/pp1ab-ൽ സ്ഥാനം 3825).എൻ-ടെർമിനസിലെ ഒന്നോ രണ്ടോ അധിക അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയ nsp9 കൺസ്ട്രക്‌റ്റ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളും ഈ നിഗമനത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.രണ്ട് സാഹചര്യങ്ങളിലും, nsp9-ന്റെ NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് UMPylation നിർത്തലാക്കി (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S7).അടുത്തതായി, nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനലിൽ 3825-NNEIMPK-3832 പെപ്റ്റൈഡ് ശ്രേണിയിൽ നിന്ന് ഇല്ലാതാക്കിയ ഒന്നോ രണ്ടോ Asn അവശിഷ്ടങ്ങളുള്ള ഒരു പ്രോട്ടീൻ ഞങ്ങൾ നിർമ്മിച്ചു.രണ്ട് സാഹചര്യങ്ങളിലും, nsp9 UMPylation പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു (ചിത്രം 5B), യഥാർത്ഥ nsp9 N-ടെർമിനസ് ഒരു NMP റിസപ്റ്ററായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു എന്നതിന് അധിക തെളിവ് നൽകുന്നു.

nsp9-ന്റെ പ്രോട്ടോലൈറ്റിക് പ്രോസസ്സിംഗും nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് UMPylation-ൽ N-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ പങ്കും.(A) nsp9 UMPylation-ന് ഒരു സൗജന്യ nsp9 N-ടെർമിനൽ ആവശ്യമാണ്.Nsp7-11-His6, റീകോമ്പിനന്റ് എംപ്രോയുടെ (nsp5-His6) സാന്നിധ്യത്തിലോ അഭാവത്തിലോ UTP അടങ്ങിയ NMPylation കണ്ടെത്തൽ ബഫറിൽ 30 °C-ൽ പ്രീ-ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തിരിക്കുന്നു.3 മണിക്കൂറിന് ശേഷം, മെറ്റീരിയലുകളിലും രീതികളിലും വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ nsp12-His6 ചേർത്ത് NMPylation അസ്സേ ആരംഭിക്കുക.nsp5-His6 (ലെയ്ൻ 1), nsp9-His6 (ലെയ്ൻ 2) എന്നിവ അടങ്ങിയ പ്രതികരണം ഒരു നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു.10 മിനിറ്റിനുശേഷം, പ്രതികരണം അവസാനിപ്പിക്കുകയും പ്രതികരണ മിശ്രിതം SDS-PAGE ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിക്കുകയും ചെയ്തു.പ്രോട്ടീൻ Coomassie Brilliant Blue (A, top) ഉപയോഗിച്ച് കളങ്കപ്പെട്ടു.Nsp7-11-His6 മുൻഗാമിയും nsp5-His6 മധ്യസ്ഥ പിളർപ്പിന്റെ ഫലമായി പ്രോസസ് ചെയ്ത ഉൽപ്പന്നവും വലതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.ഈ ജെല്ലിൽ nsp7, nsp11-His6 എന്നിവ കണ്ടെത്താനാകുന്നില്ലെന്ന് ദയവായി ശ്രദ്ധിക്കുക (അവയുടെ ചെറിയ വലിപ്പം കാരണം) പ്രതികരണം nsp5-His6 (ലേനുകൾ 1 ഉം 4 ഉം; nsp5-His6 ന്റെ സ്ഥാനം ഒരു സോളിഡ് സർക്കിൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു) അല്ലെങ്കിൽ nsp9-His6 (ലെയ്ൻ 2) MBP ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീനുകളായി (SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1) പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിനാൽ അവശിഷ്ട മാലിന്യങ്ങളായി ചെറിയ അളവിൽ MBP (ഓപ്പൺ സർക്കിളുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്) അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.(B) Nsp9-His6 വേരിയന്റിന് ഒന്നോ രണ്ടോ N-ടെർമിനൽ Asn അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഇല്ല (pp1a/pp1ab-ലെ സ്ഥാനം അനുസരിച്ച് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ നമ്പറിംഗ്) കൂടാതെ nsp12-His6, [α-32P] UTP എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു.B, SDS-PAGE, Coomassie ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തിരിക്കുന്നത് മുകളിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു, B, അനുബന്ധ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫ് താഴെ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.തന്മാത്രാ ഭാരം മാർക്കറിന്റെ സ്ഥാനം (കിലോഡാൽട്ടണുകളിൽ) ഇടതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ടെർമിനൽ സംരക്ഷിത അവശിഷ്ടങ്ങൾ Ala അല്ലെങ്കിൽ Ser ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റി, nsp12-His6 മീഡിയേറ്റഡ് UMPylation പ്രതികരണത്തിലും അതേ അളവിൽ പ്രോട്ടീൻ ഉപയോഗിച്ചു.പ്രതികരണ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ SDS-PAGE ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ച് Coomassie Brilliant Blue (C, top) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്‌തു, കൂടാതെ റേഡിയോ ലേബൽ ചെയ്‌ത nsp9-His6 ഫോസ്‌ഫോറെസെൻസ് ഇമേജിംഗ് (സി, മിഡിൽ) വഴി കണ്ടെത്തി.വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (wt) പ്രോട്ടീൻ ഒരു റഫറൻസായി (100% ആയി സജ്ജീകരിച്ചിരിക്കുന്നു) മൂന്ന് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്ന് ആപേക്ഷിക NMPylation പ്രവർത്തനം (അർത്ഥം ± SEM) കണക്കാക്കുന്നു.(D) HCoV-229E വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് Huh-7 സെല്ലുകൾ ബാധിച്ച Huh-7 സെല്ലുകളുടെ p1 സെൽ കൾച്ചർ സൂപ്പർനാറ്റന്റിലുള്ള വൈറസ് ടൈറ്ററുകളും nsp9-ൽ നിയുക്ത അമിനോ ആസിഡ് പകരക്കാരനെ വഹിക്കുന്ന മ്യൂട്ടന്റുകളും പ്ലാക്ക് പരിശോധനയിലൂടെ നിർണ്ണയിച്ചു.റെപ്ലിക്കേഷൻ-ഡിഫിഷ്യന്റ് RdRp മോട്ടിഫ് C ഇരട്ട മ്യൂട്ടന്റ് DD4823/4AA നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു.

nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനസ് (പ്രത്യേകിച്ച് 1, 2, 3, 6 എന്നീ സ്ഥാനങ്ങൾ) ഓർത്തോകൊറോണവൈറിന ഉപകുടുംബത്തിലെ അംഗങ്ങൾക്കിടയിൽ വളരെ സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S6).nsp12-mediated nsp9 NMPylation-ൽ ഈ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സാധ്യമായ പങ്ക് പഠിക്കുന്നതിനായി, nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനസിലെ തുടർച്ചയായ രണ്ട് Asn അവശിഷ്ടങ്ങൾ Ala അല്ലെങ്കിൽ Ser (ഒറ്റയ്ക്ക് അല്ലെങ്കിൽ സംയോജിതമായി) ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചു.വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് nsp9-മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, N3825-ന് പകരം Ala അല്ലെങ്കിൽ Ser ഉപയോഗിക്കുന്നത് nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് UMPylation-ൽ രണ്ട് മടങ്ങ് കുറവുണ്ടാക്കി (ചിത്രം 5C).N-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ സൈഡ് ചെയിനിന് പകരം N-ടെർമിനൽ പ്രൈമറി അമിനിലാണ് NMPylation സംഭവിക്കുന്നത് എന്ന ഞങ്ങളുടെ നിഗമനത്തിന് അനുസൃതമായി, N3825A, N3825S എന്നിവ മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നതിലൂടെ ഞങ്ങൾ ഗണ്യമായ ശേഷിക്കുന്ന NMPylation നിരീക്ഷിച്ചു.രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, രണ്ടാമത്തെ Asn-ന് പകരം Ala അല്ലെങ്കിൽ Ser ഉപയോഗിച്ചാൽ, nsp9 UMPylation കൂടുതൽ ശക്തമായി കുറയുന്നു (10 തവണയിൽ കൂടുതൽ), അതേസമയം 3, 4, 6 സ്ഥാനങ്ങളിൽ Ala മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നത് nsp9 UMPylation-ൽ മിതമായ പ്രഭാവം മാത്രമേ ഉള്ളൂ (ചിത്രം 2 )5C).ATP, CTP അല്ലെങ്കിൽ GTP (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S8) ഉപയോഗിച്ച് സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു.മൊത്തത്തിൽ, ഈ ഡാറ്റ nsp9 NMPylation-ൽ N2826 (nsp9-ൽ സ്ഥാനം 2) ന്റെ പ്രധാന പങ്ക് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

nsp9-ന്റെ N-terminus ഉം NMPylation ഉം തമ്മിലുള്ള പ്രവർത്തനപരമായ പരസ്പര ബന്ധത്തിന്റെ കൂടുതൽ തെളിവുകൾ ലഭിക്കുന്നതിന്, കൊറോണ വൈറസ് കുടുംബത്തിന്റെ (104 നും 113 നും ഇടയിൽ വ്യത്യാസമുള്ള അവശിഷ്ടങ്ങൾ) nsp9 ശ്രേണിയുടെ ഒരു മൾട്ടിപ്പിൾ സീക്വൻസ് അലൈൻമെന്റ് (MSA) ഞങ്ങൾ നടത്തി (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം എസ്6).മൊത്തത്തിൽ, വ്യത്യസ്ത സസ്തനികൾ, പക്ഷികൾ, ഉരഗങ്ങൾ എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്ന Orthocoronavirinae ഉപകുടുംബത്തിലെ 5 ജനുസ്സുകളിലുള്ള 47 (അറിയപ്പെടുന്നതും അനുമാനിക്കുന്നതുമായ) സ്പീഷീസുകളിൽ, ആകെ 8 അവശിഷ്ടങ്ങൾ മാത്രമേ മാറ്റമില്ലാത്തതായി കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ.മുമ്പത്തെ ഘടനാപരമായ പഠനങ്ങൾ (26 ??28) നിർണ്ണയിച്ച പ്രകാരം, nsp9-ന്റെ ദ്വിതീയ ഘടന ഘടകങ്ങൾ തമ്മിലുള്ള ചക്രങ്ങളിൽ ഇല്ലാതാക്കലും ഉൾപ്പെടുത്തലുകളും ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഏറ്റവും വിപുലമായ മാറ്റങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു.nsp9-ന്റെ C-ടെർമിനൽ ഭാഗത്തിന്റെ β സ്‌ട്രാൻഡിലും α ഹെലിക്‌സിലും അഞ്ച് മാറ്റമില്ലാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.മൂന്ന് മാറ്റമില്ലാത്ത അവശിഷ്ടങ്ങൾ nsp9-ന്റെ N ടെർമിനസിന്റെ NNE മോട്ടിഫാണ്.വിദൂര ബന്ധമുള്ള തവള കൊറോണ വൈറസിന്റെ സാങ്കൽപ്പിക nsp9 പങ്കിടുന്ന ഒരേയൊരു മാറ്റമില്ലാത്ത അവശിഷ്ടം ഈ രൂപത്തിന്റെ രണ്ടാമത്തെ Asn ആണെന്നും ആൽഫലെറ്റോവൈറസിന്റെ ഉപകുടുംബമായ ലെറ്റോവിറിനയിലെ മൈക്രോഹൈല ലെറ്റോവൈറസ് 1 ഇനത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.nsp9 ദ്വിതീയ ഘടന മൂലകങ്ങളിലെ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സംരക്ഷണം ഘടനാപരമായ പരിഗണനകളാൽ യുക്തിസഹമാക്കാവുന്നതാണ്, മടക്കിക്കളയുന്നതോ അറിയപ്പെടുന്ന ആർഎൻഎ ബൈൻഡിംഗ് ഗുണങ്ങളോ നിലനിർത്താൻ കഴിയും.എന്നിരുന്നാലും, ഈ ന്യായവാദം എൻഎൻഇയുടെ സംരക്ഷണത്തിന് ബാധകമല്ലെന്ന് തോന്നുന്നു, ഈ പഠനത്തിന് മുമ്പ്, ട്രൈപ്‌റ്റൈഡ് ക്രമത്തിന്റെ വ്യതിയാനത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്ന നിയന്ത്രണങ്ങളുടെ സ്വഭാവം പൂർണ്ണമായും മറഞ്ഞിരുന്നു.

കൊറോണ വൈറസ് റെപ്ലിക്കേഷനിൽ nsp9-NMPylation-ന്റെയും NNE സംരക്ഷണത്തിന്റെയും പ്രാധാന്യം നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ HCoV-229E മ്യൂട്ടന്റുകളെ നിർമ്മിച്ചു, അവ nsp9 N-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സിംഗിൾ അല്ലെങ്കിൽ ഡബിൾ സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ വഹിക്കുന്നു, ഇത് വിട്രോയിൽ nsp9 NMPylation ദോഷകരമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഞങ്ങൾ ആരംഭിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, ഈ സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ (nsp8|9 cleavage സൈറ്റിന് സമീപം) C-ടെർമിനൽ pp1a റീജിയന്റെ പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക് പ്രോസസ്സിംഗിനെ ബാധിക്കുമോ എന്ന ചോദ്യത്തിന് ഉത്തരം നൽകാൻ ഞങ്ങൾ ശ്രമിക്കുന്നു.nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനസിലെ അനുബന്ധമായ പകരക്കാർ അടങ്ങുന്ന ഒരു കൂട്ടം nsp7-11 പോളിപ്രോട്ടീൻ നിർമ്മിതികൾ E. coli-ൽ നിർമ്മിക്കുകയും റീകോമ്പിനന്റ് Mpro ഉപയോഗിച്ച് മുറിക്കുകയും ചെയ്തു.എം‌പ്രോ-മെഡിയേറ്റഡ് nsp8|9 ക്ലേവേജിൽ ഇടപെടുന്ന ഈ പ്രോട്ടീനുകളിലെ ഘടനാപരമായ മാറ്റങ്ങൾ ഒഴികെ (എസ്‌ഐ അനുബന്ധം, ചിത്രം എസ് 9) നാല് സൈറ്റുകളുടെ (എൻ‌എസ്‌പി 9 ഫ്ലാങ്കിംഗ് സൈറ്റ് ഉൾപ്പെടെ) പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക് പിളർപ്പിനെ, അവതരിപ്പിച്ച ഏതെങ്കിലും സബ്‌സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ കാര്യമായി ബാധിക്കില്ല. വെബ്സൈറ്റ്.

Huh-7 സെല്ലുകൾ ജനിതക-ദൈർഘ്യമുള്ള HCoV-229E RNA ഉപയോഗിച്ച് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെട്ടു, nsp9 N ടെർമിനസിലെ സംരക്ഷിത NNE ട്രൈപ്‌റ്റൈഡുകളിൽ (N3825, N3826, E3827) Ala അല്ലെങ്കിൽ Ser സബ്‌സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ എൻകോഡ് ചെയ്തു, മിക്ക മ്യൂട്ടേഷനുകളും മാരകമാണെന്ന് കാണിക്കുന്നു.N-ടെർമിനൽ Asn-ന്റെ (N2835A അല്ലെങ്കിൽ N2835S) Ser അല്ലെങ്കിൽ Ala മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾക്ക് വൈറസിനെ രക്ഷിക്കാൻ കഴിഞ്ഞു, എന്നാൽ NNE ശ്രേണിയിലെ (N3826A, N3826S, NN3825/6AA,) മറ്റ് സിംഗിൾ, ഡബിൾ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് വൈറസ് വീണ്ടെടുക്കുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു. NN3825/6SS) , E3827A) (ചിത്രം 5D).

ടിഷ്യു കൾച്ചറിലെ കൊറോണ വൈറസുകളുടെ തനിപ്പകർപ്പ് നിയന്ത്രിച്ചിരിക്കുന്നു (ഒരേ അല്ലെങ്കിൽ സമാനമായത്), ശരീരത്തിലെ nsp9 NMPylation സൈറ്റുകളുടെ സ്വാഭാവിക പരിവർത്തനത്തെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു, കൂടാതെ കൊറോണ വൈറസുകളുടെ ജീവിത ചക്രത്തിൽ ഈ പ്രതികരണത്തിന്റെ പ്രധാന പങ്കിനെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നുവെന്നും ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

അവസാനത്തെ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, ഞങ്ങൾ SARS-CoV-2 nsp12, nsp9 എന്ന് ലേബൽ ചെയ്‌ത C-terminal His6 ഉം E. coli-യിൽ nsp12-ന്റെ രണ്ട് രൂപാന്തരപ്പെട്ട രൂപങ്ങളും നിർമ്മിച്ചു.NiRAN, RdRp ഡൊമെയ്‌നുകളിലെ സജീവമായ സൈറ്റിന്റെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ യഥാക്രമം Ala ഉപയോഗിക്കുക എന്നതായിരുന്നു (ചിത്രം 6A, SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S2).SARS-CoV-2 nsp12-ലെ K4465, HCoV-229E-ലെ K4135-ന് സമാനമാണ് (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S2), ഇത് NiRAN പ്രവർത്തനത്തിനും HCoV-229E പകർപ്പിനും ആവശ്യമാണെന്ന് തെളിഞ്ഞു (ചിത്രം 3D, E).ഈ അവശിഷ്ടം ആർട്ടീരിയൽ വൈറസ് EAV nsp9 K94 അവശിഷ്ടവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് NiRAN സെൽഫ്-UMPylation/self-GMPylation (16)-ന് ആവശ്യമാണെന്ന് മുമ്പ് കാണിച്ചിരുന്നു.ചിത്രം 6B-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, SARS-CoV-2 nsp12-ന് nsp9 ഒരു സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റായി ഉപയോഗിച്ചുള്ള UMP ട്രാൻസ്‌ഫറസ് ആക്‌റ്റിവിറ്റിയുണ്ട്, അതേസമയം nsp12_K4465A സജീവമായ സൈറ്റ് മ്യൂട്ടന്റ് നിഷ്‌ക്രിയമാണ്.RdRp മോട്ടിഫ് C യുടെ SDD സ്വഭാവസവിശേഷത ശ്രേണിയിലെ ഇരട്ട പകരം വയ്ക്കൽ UMP ട്രാൻസ്ഫർ ആക്റ്റിവിറ്റിയെ ബാധിക്കില്ല (ചിത്രം 6B), RdRp പ്രവർത്തനത്തിന് nsp9 UMPylation-ൽ നേരിട്ട് സ്വാധീനമില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.CTP, GTP, ATP എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് സമാനമായ ഡാറ്റ ലഭിച്ചു (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S10).ചുരുക്കത്തിൽ, ഓർത്തോകൊറോണവൈറസ് ഉപകുടുംബത്തിലെ വിവിധ ജനുസ്സുകളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന കൊറോണ വൈറസുകളിൽ NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് nsp9 NMPylation ന് യാഥാസ്ഥിതിക പ്രവർത്തനമുണ്ടെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.

SARS-CoV-2 nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് NMPylation of nsp9.(A) NMPylation ടെസ്റ്റിൽ ഉപയോഗിച്ചിരിക്കുന്ന റീകോമ്പിനന്റ് പ്രോട്ടീൻ കാണിക്കുന്ന Coomassie സ്റ്റെയിൻഡ് SDS-polyacrylamide ജെൽ.ഒരു നിയന്ത്രണമെന്ന നിലയിൽ, SARS-CoV-2 nsp12-ന്റെ NiRAN ഡൊമെയ്‌നിലും (K4465A) RdRp ഡൊമെയ്‌നിലും (DD5152/3AA) സജീവമായ സൈറ്റ് സബ്‌സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുള്ള ഒരു മ്യൂട്ടന്റ് പ്രോട്ടീൻ ഉപയോഗിച്ചു.pp1ab-ലെ സ്ഥാനത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയാണ് അവശിഷ്ട നമ്പറിംഗ്.(B) nsp9-His6, [α-32P]UTP എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് nsp12-His6 (വൈൽഡ് ടൈപ്പ് [wt], മ്യൂട്ടന്റ്) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് UMPylation കണ്ടെത്തലിന്റെ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫ്.ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോട്ടീന്റെ തന്മാത്രാ പിണ്ഡം (കിലോഡാൽട്ടണിൽ) ഇടതുവശത്ത് കാണിച്ചിരിക്കുന്നു.

NirAN ഡൊമെയ്‌നുകൾ സാധാരണയായി നിഡോവൈറൽസിൽ (16) സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു, ഇത് നിഡോവൈറസ് പകർപ്പിന് ആവശ്യമായ എൻസൈമാറ്റിക് പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങളെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഈ പഠനത്തിൽ, കൊറോണ വൈറസിന്റെ NiRAN ഡൊമെയ്‌ൻ NMP (NTP-ൽ നിന്ന് സൃഷ്‌ടിച്ചത്) nsp9-ലേക്ക്, വൈറസ് പകർപ്പിൽ (26 ?? 29) ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന നിഗൂഢമായ RNA ബൈൻഡിംഗ് പ്രോട്ടീനിലേക്ക് മാറ്റുന്നുവെന്ന് തെളിയിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു. കൊറോണ വൈറസ് ആർടിസിയുടെ പങ്കാളി.

NiRAN ഡൊമെയ്‌ൻ മൂന്ന് സീക്വൻസ് മോട്ടിഫുകൾ (AN, BN, CN) പങ്കിടുന്നു, അവയിൽ വളരെ കുറച്ച് അവശിഷ്ടങ്ങൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, അവ മോണോഫൈലെറ്റിക് എന്നാൽ വളരെ വ്യത്യസ്തമായ നിഡോവൈറൽസ് ക്രമത്തിൽ (8, 16) എല്ലാ കുടുംബങ്ങളിലും സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു.സമീപകാല പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് അവ ഘടനാപരമായി പ്രോട്ടീൻ കൈനാസ് പോലുള്ള പ്രോട്ടീനുകളുടെ വലിയൊരു സ്വഭാവമില്ലാത്ത കുടുംബവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, അവ യഥാർത്ഥത്തിൽ SelO കുടുംബം (17, 19, 22, 30, 31) എന്ന് വിളിച്ചിരുന്നു.സെലോയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകൾക്ക് കൈനസ് ഫോൾഡുകൾ ഉണ്ട്, എന്നാൽ ക്ലാസിക്കൽ കൈനാസുകളിൽ (22, 32) സംരക്ഷിത സജീവമായ സൈറ്റിന്റെ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഇല്ല.എടിപി തന്മാത്രകളുടെ റിവേഴ്സ് ഓറിയന്റേഷനെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, സജീവമായ സൈറ്റിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിച്ച് നിർദ്ദിഷ്ട ഇടപെടലുകളാൽ സ്ഥിരത കൈവരിക്കുന്നു, സെൽഒ അനുമാനിക്കുകയും പിന്നീട് എഎംപി (ഫോസ്ഫേറ്റിന് പകരം) പ്രോട്ടീൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിലേക്ക് (22) കൈമാറുമെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തു, അതേസമയം മറ്റൊരു ബാക്ടീരിയൽ സെലോ പോലുള്ള പ്രോട്ടീൻ YdiU ഉണ്ട്. ടൈറുമായുള്ള യു‌എം‌പിയുടെ കോവാലന്റ് അറ്റാച്ച്‌മെന്റിനെയും വ്യത്യസ്ത പ്രോട്ടീൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളുടെ അവശിഷ്ടങ്ങളെയും ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതായി അടുത്തിടെ കാണിക്കുന്നു (33).

കൊറോണ വൈറസ് NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന്റെ സജീവമായ സൈറ്റിന്റെ അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ പ്രവചനം സ്ഥിരീകരിക്കുന്നതിനും വിപുലീകരിക്കുന്നതിനും, കൊറോണ വൈറസ് nsp12-ൽ മ്യൂട്ടേഷൻ വിശകലനം നടത്താൻ ഞങ്ങൾ ബയോകെമിക്കൽ, റിവേഴ്സ് ജനറ്റിക്സ് രീതികൾ ഉപയോഗിച്ചു (ചിത്രം 3D, E, SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S3, പട്ടിക) S1â എസ്4).HCoV-229E K4135, R4178, D4280 എന്നിവയെ Ala ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നത് ഇൻ വിട്രോ NMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനവും സെൽ കൾച്ചറിലെ വൈറസ് റെപ്ലിക്കേഷനും ഇല്ലാതാക്കുമെന്ന് ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു (ചിത്രം 3D, E, SI അനുബന്ധങ്ങൾ, ചിത്രം S3), NTP γ-ഫോസ്ഫേറ്റിൽ അവയുടെ സാന്നിധ്യത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. (K4135, R4178) കൂടാതെ സജീവമായ സൈറ്റ് മെറ്റൽ അയോണുകളുടെ ഏകോപനം (D4280).K4135 (17) സ്ഥാനം സ്ഥിരപ്പെടുത്തുമെന്ന് പ്രവചിക്കപ്പെട്ട പക്ഷികളുടെ നെസ്റ്റ് വൈറസിന്റെ പരിധിയിലുള്ള സംരക്ഷിത ഗ്ലൂവിന്റെ E4145A പകരം വയ്ക്കുന്നത് വൈറൽ റെപ്ലിക്കേഷൻ ഇല്ലാതാക്കുന്നതായി കാണിച്ചു, എന്നാൽ അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഇൻ വിട്രോ NMPylation അസെയിൽ പ്രവർത്തനം നിലനിർത്തി (ചിത്രം 3D, E എന്നിവയും. SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S3, പട്ടികകൾ S1-S4).സാൽമൊണെല്ല ടൈഫിമുറിയത്തിന്റെ (E130A) (33) YdiU ഹോമോലോഗിൽ അനുബന്ധമായ പകരം വയ്ക്കൽ അവതരിപ്പിച്ചപ്പോൾ സമാനമായ ഒരു നിരീക്ഷണം നടത്തി.ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഡാറ്റ കാറ്റലറ്റിക് ഫംഗ്ഷനേക്കാൾ ഈ സംരക്ഷിത അവശിഷ്ടത്തിന്റെ നിയന്ത്രണ പ്രവർത്തനത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.

HCoV-229E NiRAN ഡൊമെയ്‌നിലെ (8) നെസ്‌റ്റോവൈറസിന്റെ പരിധിക്കുള്ളിൽ സംരക്ഷിത Phe അവശിഷ്ടം (F4281A) മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുന്നത് വിട്രോയിലെ NMPylation പ്രവർത്തനത്തിൽ കുറവുണ്ടാക്കുകയും സെൽ കൾച്ചറിലെ വൈറസ് പകർപ്പിൽ ഗണ്യമായ കുറവുണ്ടാക്കുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം 3D, E, SI) അനുബന്ധം, ചിത്രം S3).മുമ്പ് കാണിച്ചിരിക്കുന്ന ഹോമോലോഗസ് DFG മോട്ടിഫ് Phe അവശിഷ്ടം പോലെയുള്ള ഈ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ പ്രധാന നിയന്ത്രണ പ്രവർത്തനവുമായി ഡാറ്റ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.ക്ലാസിക്കൽ പ്രോട്ടീൻ കൈനാസുകളിൽ, ഇത് Mg2+ ബൈൻഡിംഗ് ലൂപ്പിന്റെ ഭാഗമാണ്, നട്ടെല്ല് കൂട്ടിച്ചേർക്കാനും നിയന്ത്രിക്കാനും ഇത് സഹായിക്കുന്നു???ഫലപ്രദമായ കാറ്റലറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തിന് ആവശ്യമാണ് (32, 34).K4116 അവശിഷ്ടങ്ങൾക്കായി Ala, Arg എന്നിവ യഥാക്രമം (പ്രീഎൻ മോട്ടിഫിൽ), വൈറൽ റെപ്ലിക്കേഷൻ ഒഴിവാക്കി, പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, അവതരിപ്പിച്ച അമിനോ ആസിഡ് സൈഡ് ചെയിൻ അനുസരിച്ച്, വിട്രോയിലെ NMP ട്രാൻസ്ഫറസ് പ്രവർത്തനത്തിൽ വ്യത്യസ്ത ഫലങ്ങൾ ഉണ്ടാക്കി (ചിത്രം 3D, E, SI അനുബന്ധങ്ങൾ , ചിത്രം S3).പ്രവർത്തനപരമായ ഡാറ്റ ഘടനാപരമായ വിവരങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഈ അവശിഷ്ടം ATP ഫോസ്ഫേറ്റുമായി (17) ഒരു ഇടപെടൽ സ്ഥാപിച്ചിട്ടുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.മറ്റ് നെസ്റ്റഡ് വൈറസ് കുടുംബങ്ങളുടെ NiRAN ഡൊമെയ്‌നിൽ, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ന്റെ സ്ഥാനം Lys, Arg അല്ലെങ്കിൽ His (8) കൈവശപ്പെടുത്തിയിരിക്കുന്നു, ഇത് ഈ പ്രത്യേക അവശിഷ്ടത്തിന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ നിയന്ത്രണത്തിൽ ഇളവ് വരുത്തിയതായി സൂചിപ്പിക്കുന്നു.D4188A, D4283A എന്നിവയുടെ പകരക്കാരൻ എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തെ ഇല്ലാതാക്കുകയോ ശക്തമായി കുറയ്ക്കുകയോ ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ വൈറസ് പകർപ്പെടുക്കൽ ഇല്ലാതാക്കുന്നു (ചിത്രം 3).ഈ രണ്ട് അവശിഷ്ടങ്ങളും ഒട്ടുമിക്ക (എല്ലാം അല്ല) നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളിൽ (8) സംരക്ഷിക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് ഒരു പ്രധാന കുടുംബ-നിർദ്ദിഷ്‌ടവും എന്നാൽ ഒരുപക്ഷേ ഉത്തേജകമല്ലാത്തതുമായ പ്രവർത്തനത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൊറോണവൈറിഡേയിലോ മറ്റ് നെസ്‌റ്റിയോവൈരിഡേ കുടുംബങ്ങളിലോ (8) സംരക്ഷിക്കപ്പെടാത്ത മറ്റ് നിരവധി ലൈസ്, ആസ്‌പ് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) Ala പകരം വയ്ക്കുന്നത് നിയന്ത്രണങ്ങളായി ഉപയോഗിച്ചു.പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തിൽ നേരിയ കുറവും ചില സന്ദർഭങ്ങളിൽ വൈറൽ റെപ്ലിക്കേഷനും (ചിത്രം 3, SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S3).മൊത്തത്തിൽ, കൊറോണ വൈറസ് മ്യൂട്ടജെനിസിസ് ഡാറ്റ EAV NiRAN-RdRp (16) ന്റെ സെൽഫ്-ജിഎംപി, റിവേഴ്സ് ജനറ്റിക്സ് ഡാറ്റയുമായി വളരെ സ്ഥിരത പുലർത്തുന്നു, അതിൽ EAV nsp9 (കൊറോണ വൈറസ് nsp12 ഓർത്തോലോഗ്) അവശിഷ്ടം K94 (HCoV- 229E K4135 ന് അനുസൃതമായി) പ്രധാന പ്രവർത്തനങ്ങൾ. R124 (R4178 ന് അനുസൃതമായി), D132 (D4188 ന് അനുസൃതമായി), D165 (D4280 ന് അനുസൃതമായി), F166 (F4281 ന് അനുസൃതമായി).കൂടാതെ, HCoV-229E മ്യൂട്ടജെനിസിസ് ഡാറ്റ, മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത SARS-CoV റിവേഴ്സ് ജനറ്റിക്സ് ഡാറ്റയുമായി (16) സ്ഥിരത പുലർത്തുകയും വിപുലീകരിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, അത് അനുബന്ധ CN മോട്ടിഫായ Phe-to-Ala മ്യൂട്ടന്റ് SARS-CoV_nsp12 ന് സമാനമായി നിരീക്ഷിച്ചതിന് സമാനമാണ്. ഫിനോടൈപ്പ് വിവരിച്ച -F219A, HCoV-229E_F4281A (ചിത്രം 3 D, E, SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S3, പട്ടിക S1-S4).

UTP, GTP എന്നിവയ്‌ക്ക് വ്യക്തമായ മുൻഗണനയുള്ള EAV ഓർത്തോലോഗുകളുമായി (16) താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ (സ്വയം-NMPylation പ്രതികരണത്തിൽ), കൊറോണ വൈറസ് NiRAN ഡൊമെയ്‌ന് (HCoV-229E, SARS-CoV-2 എന്നിവ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നത്) ഫലപ്രദമായി പ്രവർത്തിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഞങ്ങളുടെ പഠനം കാണിക്കുന്നു. എല്ലാ നാല് NMP-കളും ട്രാൻസ്ഫർ ചെയ്തു, UMP- യ്ക്ക് നേരിയ മുൻഗണന ഉണ്ടെങ്കിലും (ചിത്രങ്ങൾ 1 ഉം 3 ഉം).നിർദ്ദിഷ്‌ട NTP കോ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റിന്റെ താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ പ്രത്യേകത, അടുത്തിടെ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്‌ത SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 സൂപ്പർ കോമ്പോസിറ്റ് ഘടനയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇതിൽ ADP-Mg2+ NiRAN-ന്റെ സജീവ സൈറ്റുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു, എന്നാൽ അഡിനൈൻ ഭാഗവുമായി ബന്ധപ്പെടുത്തുന്നില്ല. നിർദ്ദിഷ്ട ഇടപെടലുകളുടെ രൂപീകരണം (17).ഞങ്ങളുടെ പഠനത്തിൽ, NMPylation പ്രതിപ്രവർത്തനത്തിൽ ഉപയോഗിക്കുന്ന ന്യൂക്ലിയോടൈഡിന്റെ തരം മ്യൂട്ടന്റ് പ്രോട്ടീന്റെ (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S3) പ്രവർത്തനത്തെ വ്യത്യസ്തമായി ബാധിക്കുന്നില്ല, ഈ അവശിഷ്ടങ്ങളൊന്നും ഒരു നിർദ്ദിഷ്ട ന്യൂക്ലിയോബേസിന്റെ ബൈൻഡിംഗുമായി അടുത്ത ബന്ധമില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.കൊറോണ വൈറസുകളുടെയും ധമനികളിലെ വൈറസുകളുടെയും നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന വ്യത്യസ്ത NTP കോ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് മുൻഗണനകളുടെ ഘടനാപരമായ അടിത്തറയും സാധ്യതയുള്ള ജൈവ പ്രാധാന്യവും പഠിക്കേണ്ടതുണ്ട്;അവ ശരിയായിരിക്കാം അല്ലെങ്കിൽ അവരുടെ പഠനത്തിന്റെ പരിമിതികൾ മൂലമാകാം.നിലവിൽ, ധമനിയും കൊറോണ വൈറസും തമ്മിലുള്ള സാമ്യം കണക്കിലെടുത്ത്, ആർട്ടീരിയൽ വൈറസ് നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (നേരത്തെ സ്വഭാവമുള്ള സെൽഫ്-എൻഎംപിലേഷൻ പ്രവർത്തനവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ) സാധ്യതയുള്ള എൻഎംപിലേറ്റർ പ്രവർത്തനത്തിന് വ്യത്യസ്തമായ സഹ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് മുൻഗണനയുണ്ടെന്ന് തള്ളിക്കളയാനാവില്ല. NiRAN ഡൊമെയ്ൻ അതിന്റെ പരിധിയിലാണ്.സീക്വൻസ് അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള താരതമ്യം (16).Mg2+ ഒരു കോഫാക്ടറായി ഉപയോഗിക്കുന്ന pseudokinase SelO-യുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, കൊറോണ വൈറസിന്റെയും ആർട്ടീരിയൽ വൈറസിന്റെയും NiRAN-ന്റെ പ്രവർത്തനം Mn2+ (16) യെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു (ചിത്രം 3C, SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S1).Mn2+ ആശ്രിതത്വവും UTP-നുള്ള വ്യക്തമായ മുൻഗണനയും പ്രോട്ടീൻ NMPylators ന്റെ അസാധാരണമായ ഒരു സവിശേഷതയാണ്, ഇത് അടുത്തിടെയാണ് സാൽമൊണല്ല ടൈഫിമൂറിയത്തിന്റെ YdiU പ്രോട്ടീനിൽ സ്ഥിരീകരിച്ചത്, ഇത് സ്ട്രെസ് ഇൻഡക്ഷൻ സെൽ ATP പൂളിൽ നിന്ന് കോശങ്ങളെ സംരക്ഷിക്കുന്നതിന് കർശനമായ Mn2+-ആശ്രിത പ്രോട്ടീൻ ചാപ്പറോൺ UMPylation ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു ( 33).

കൊറോണ വൈറസ് നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നും സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീൻ കൈനസുകളും (17, 19) തമ്മിലുള്ള അടുത്തിടെ വിവരിച്ച ഘടനാപരമായ സാമ്യം, ഈ പഠനത്തിൽ ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്‌ത മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുമായി എൻ‌എം‌പിയെ കോവാലന്റ് ആയി ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള NiRAN-ന്റെ കഴിവിന് അധിക പിന്തുണ നൽകുന്നു.RTC-യുടെ ORF1b-എൻകോഡ് ചെയ്ത പകർപ്പിനെ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ സഹായിക്കാൻ അറിയപ്പെടുന്ന HCoV-229E ORF1a എൻകോഡ് ചെയ്ത പ്രോട്ടീനുകളിൽ സാധ്യമായ NiRAN ടാർഗെറ്റുകൾക്കായുള്ള ഞങ്ങളുടെ തിരച്ചിൽ ഞങ്ങൾ കേന്ദ്രീകരിച്ചു (12, 35).ഞങ്ങളുടെ പരീക്ഷണങ്ങൾ nsp9 ന്റെ ഫലപ്രദവും നിർദ്ദിഷ്ടവുമായ NMPylation ന് നിർണായകമായ തെളിവുകൾ നൽകുന്നു (ചിത്രം 2).എൻസൈമിന്റെ (nsp12)തിനേക്കാൾ 8 മുതൽ 10 മടങ്ങ് വരെ കൂടുതലുള്ള മോളാർ അധികമായി ടാർഗെറ്റ് പ്രോട്ടീൻ ഉപയോഗിക്കുകയാണെങ്കിൽ, nsp9 പൂർണ്ണമായും (മോണോ)NMP ചെയ്തതാണെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 4).nsp12 ഉം nsp9 ഉം തമ്മിലുള്ള ഇടപെടൽ ഹ്രസ്വകാലമാണെന്നും nsp9 (മറ്റ് RTC ഉപയൂണിറ്റുകളുടെ അഭാവത്തിൽ) ഒരു സ്ഥിരതയുള്ള സമുച്ചയം രൂപീകരിക്കില്ലെന്നും ഞങ്ങൾ നിഗമനം ചെയ്തു.SARS-CoV പ്രോട്ടിയോമിലെ പ്രോട്ടീൻ ഇന്ററാക്ഷൻ പഠനങ്ങൾ ഈ നിഗമനത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു (35).MS വിശകലനം nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ പ്രാഥമിക അമിനെ NMPylation സൈറ്റായി തിരിച്ചറിഞ്ഞു (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5).ഫോസ്‌ഫോറാമിഡേറ്റ് ബോണ്ടിന്റെയും എൻ-ടെർമിനൽ അമിനോ ഗ്രൂപ്പിന്റെയും രൂപീകരണം നിറാൻ-മധ്യസ്ഥതയുള്ള എൻഎംപിലേഷൻ പ്രവർത്തനത്തെ സ്യൂഡോമോണസ് സിറിംഗേ സെലോ-മെഡിയേറ്റഡ് എഎംപിലേഷൻ റിയാക്ഷനിൽ നിന്ന് വേർതിരിക്കുന്നു, ഇത് സെർ, ത്രർ, അല്ലെങ്കിൽ ടൈർ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ഒ-ലിങ്ക്ഡ് എഎംപി രൂപീകരണത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നു. 22), കൂടാതെ എസ്. ടൈഫിമുറിയം YdiU ഒ-ലിങ്ക്ഡ് (ടൈറിനൊപ്പം), എൻ-ലിങ്ക്ഡ് (അവനോടൊപ്പം) പെപ്റ്റൈഡ്-യുഎംപി അഡക്‌റ്റുകൾ രൂപീകരിക്കുന്നു.പ്രോട്ടീനുകളുടെ സെലോ കുടുംബത്തിൽ ലഭ്യമായ പരിമിതമായ വിവരങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഈ വലിയ പ്രോട്ടീൻ കുടുംബത്തിലെ അംഗങ്ങൾ പെപ്റ്റൈഡ്-എൻഎംപി അഡക്റ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തിൽ വളരെ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്നാണ്.കൂടുതൽ പഠനം അർഹിക്കുന്ന രസകരമായ ഒരു നിരീക്ഷണമാണിത്.

ഈ പഠനത്തിൽ ലഭിച്ച ഡാറ്റ, nsp9-ന്റെ NMPylation-ന് ഒരു സൗജന്യ N-ടെർമിനസ് ആവശ്യമാണെന്ന് അനുമാനിക്കാൻ ഞങ്ങളെ നയിച്ചു.വൈറൽ റെപ്ലിക്കേഷന്റെ പശ്ചാത്തലത്തിൽ, MPro, pp1ab എന്നിവ മധ്യസ്ഥതയിലുള്ള പോളിപ്രോട്ടീൻ pp1a റെപ്ലിക്കേസിലെ nsp8|nsp9 പ്രോസസ്സിംഗ് സൈറ്റിന്റെ പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക് ക്ലീവേജ് വഴി ഇത് നൽകും.മിക്ക കൊറോണ വൈറസുകളിലും, ഈ നിർദ്ദിഷ്ട സൈറ്റും (HCoV-229E-യിലെ VKLQ|NNEI) മറ്റെല്ലാ കൊറോണ വൈറസ് Mpro ക്ലിവേജ് സൈറ്റുകളും തമ്മിലുള്ള വ്യത്യാസം Asn ആണ് (അല, സെർ അല്ലെങ്കിൽ ഗ്ലൈ പോലെയുള്ള മറ്റൊരു ചെറിയ അവശിഷ്ടത്തിന് പകരം) P1â???സ്ഥലം (36).ആദ്യകാല പഠനങ്ങളിൽ ലഭിച്ച പെപ്റ്റൈഡ് ക്ലീവേജ് ഡാറ്റ, nsp8|nsp9 സൈറ്റിന്റെ ക്ലീവേജ് കാര്യക്ഷമത മറ്റ് സൈറ്റുകളേക്കാൾ കുറവാണെന്ന് കാണിക്കുന്നു, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് 1) ഈ നിർദ്ദിഷ്ട സൈറ്റിന് സി-ടെർമിനലിന്റെ സമയോചിതമായ ഏകോപിത പ്രോസസ്സിംഗിൽ ഒരു റെഗുലേറ്ററി റോൾ ഉണ്ടായിരിക്കാം എന്നാണ്. pp1a മേഖല, അല്ലെങ്കിൽ 2) a വൈറസ് റെപ്ലിക്കേഷനിൽ പ്രത്യേക സംരക്ഷിത nsp9 N-ടെർമിനസിന്റെ പങ്ക് (37).ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ (ചിത്രം 5A) യഥാർത്ഥ N-ടെർമിനൽ സീക്വൻസ് വഹിക്കുന്ന nsp9-ന്റെ റീകോമ്പിനന്റ് ഫോം nsp12 ഫലപ്രദമായി NMP ചെയ്തതായി കാണിച്ചു.ഫാക്ടർ Xa (nsp9-His6; SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1) അല്ലെങ്കിൽ Mpro-മെഡിയേറ്റഡ് ക്ലീവേജ് (nsp7-11-His6; ചിത്രം 5A, SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1) വഴി N-ടെർമിനൽ ഫ്ലാങ്കിംഗ് സീക്വൻസ് നീക്കം ചെയ്തു.പ്രധാനമായി, അൺകട്ട് nsp9 അടങ്ങിയ മുൻഗാമി nsp7-11-His6 nsp12 ന്റെ NMPylation ന് പ്രതിരോധം കാണിച്ചു, ഇത് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റയുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ഇത് N-ടെർമിനൽ പ്രൈമറി അമിൻ വഴിയാണ് nsp9-NMP അഡക്റ്റ് രൂപപ്പെടുന്നത് എന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S5) .NiRAN സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റ് സവിശേഷതയെക്കുറിച്ച് ആഴത്തിലുള്ള ധാരണ നേടുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ nsp9-ന്റെ അടുത്തുള്ള N-ടെർമിനൽ അവശിഷ്ടങ്ങളിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു.മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെ അഭാവത്തിൽ, അവ ഘടനാപരമായി വഴക്കമുള്ളവയാണ്, അവ nsp9 (26 28, 38) എന്ന ലേബൽ ചെയ്യാത്ത രൂപത്തിൽ കണ്ടെത്തുന്നതിൽ നിന്ന് തടയുന്നു, അവയുടെ പരിമിതമായ സ്വാഭാവിക വ്യതിയാനത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് പ്രധാനപ്പെട്ട ക്രമം-നിർദ്ദിഷ്ട (ദ്വിതീയ ഘടനയുമായി ബന്ധപ്പെട്ടതല്ല) nsp9 N-ടെർമിനൽ ശകലത്തിന്റെ പ്രവർത്തനം.ഈ മേഖലയിലെ സംരക്ഷിത അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ Ala പകരം വയ്ക്കുന്നത് (ചിത്രങ്ങൾ 5C, D, SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S8) വിട്രോയിലെ nsp9 NMPylation-ന് N3826 അത്യന്താപേക്ഷിതമാണെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തുന്നു, അതേസമയം N3825A, E3827A എന്നിവ NMPylation കുറയുന്നതിന് കാരണമാകുന്നു, അതേസമയം M3820A, P3820A എന്നിവയ്ക്ക് പകരമാവില്ല. .വ്യക്തമായും nsp9 NMPylation ബാധിക്കും.N-ടെർമിനൽ Asn (N3825A, N3825S) പകരം വയ്ക്കുന്നത് nsp9 NMPylation, സെൽ കൾച്ചറിലെ വൈറസ് പകർപ്പെടുക്കൽ (ചിത്രം 5C, D), N-ടെർമിനൽ 3825-NN dipeptide-ൽ നിന്ന് ഒരു Asn അവശിഷ്ട ശ്രേണി ഇല്ലാതാക്കൽ എന്നിവയിൽ മിതമായ സ്വാധീനം മാത്രമേ ചെലുത്തൂ. ഇത് വൈറസുകൾക്ക് മാരകമാണെന്ന് തെളിയിക്കപ്പെട്ടു, N-ടെർമിനസിലെ മറ്റൊരു അവശിഷ്ടത്തിന് മുമ്പ് ഒരു Asn അവശിഷ്ടം ആവശ്യമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു, വെയിലത്ത് Asn, സമാനമായ അവശിഷ്ടങ്ങൾ ഭാഗികമായി സഹിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് തോന്നുന്നു (ചിത്രം 5B, C, D).3825-NN dipeptide, പ്രത്യേകിച്ച് കൊറോണ വൈറസ് ശ്രേണിയിലെ (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S6) സംരക്ഷിതവും അത്യാവശ്യവുമായ N3826 അവശിഷ്ടം, NiRAN-ന്റെ സജീവ സൈറ്റിൽ nsp9 N-ടെർമിനസിന്റെ ശരിയായ ബൈൻഡിംഗും ഓറിയന്റേഷനും ഉറപ്പാക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ നിഗമനം ചെയ്യുന്നു.

എല്ലാ ഉപകുടുംബങ്ങളിലെയും സംരക്ഷിത ഗ്ലൂവിന് Ala (E3827A) പകരം വയ്ക്കുന്നത് വിട്രോയിൽ nsp9 NMPylation നിലനിർത്തുന്നു, എന്നാൽ സെൽ കൾച്ചറിലെ വൈറസുകൾക്ക് മാരകമാണ് (ചിത്രം 5C, D), ഈ അവശിഷ്ടത്തിന്റെ അധിക പ്രവർത്തനത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഉദാഹരണത്തിന്, പ്രധാന ഇടപെടലുകളിൽ (NMPylated അല്ലെങ്കിൽ unmodified). ) nsp9 N-ടെർമിനസും വൈറസ് പകർപ്പെടുക്കലിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന മറ്റ് ഘടകങ്ങളും.Nsp9 മ്യൂട്ടേഷനുകൾ nsp9 അല്ലെങ്കിൽ അടുത്തുള്ള ഏതെങ്കിലും nsps (39) (SI അനുബന്ധം, ചിത്രം S9) ന്റെ പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക് പ്രക്രിയയെ ബാധിച്ചില്ല, നിരീക്ഷിച്ച നിരവധി nsp9 മ്യൂട്ടേഷനുകളുടെ മാരകമായ പ്രതിഭാസങ്ങൾ C പ്രോട്ടിയോലൈറ്റിക് പ്രോസസ്-ടെർമിനൽ pp1a ഏരിയയുടെ ക്രമരഹിതമായതിനാൽ സംഭവിച്ചതല്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. .

pp1a/pp1ab-ലെ nsp8|9 ക്ലീവേജ് സൈറ്റിന്റെ Mpro-മെഡിയേറ്റഡ് ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, nsp9-ന്റെ N-ടെർമിനസ് UMPylated (അല്ലെങ്കിൽ മറ്റൊരു NMP ഉപയോഗിച്ച് ഭാഗികമായി പരിഷ്‌ക്കരിക്കാൻ) കഴിയുമെന്നതിന് മുകളിലുള്ള ഡാറ്റ തെളിവുകൾ നൽകുന്നു.കൂടാതെ, nsp9 ന്റെ N-ടെർമിനസിന്റെ മികച്ച സംരക്ഷണവും (കൊറോണ വൈറസ് കുടുംബത്തിലെ ഏകവചനവും മാറ്റമില്ലാത്ത Asn അവശിഷ്ടങ്ങളും ഉൾപ്പെടെ) ഈ പഠനത്തിൽ ലഭിച്ച റിവേഴ്സ് ജനിതക ഡാറ്റയും (ചിത്രങ്ങൾ 3E, 5D) വിവരിച്ച nsp9 NMPylation എന്ന നിഗമനത്തിലേക്ക് ഞങ്ങളെ നയിച്ചു. ജൈവശാസ്ത്രപരമായി ബന്ധപ്പെട്ടതും കൊറോണ വൈറസ് പകർപ്പിന് അത്യന്താപേക്ഷിതവുമാണ്.ഈ പരിഷ്‌ക്കരണത്തിന്റെ പ്രവർത്തനപരമായ അനന്തരഫലങ്ങൾ പഠിക്കാനുണ്ട്, ഉദാഹരണത്തിന്, മുമ്പ് വിവരിച്ച (നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത) nsp9 (മാറ്റം വരുത്താത്ത ഫോം) RNA ബൈൻഡിംഗ് ആക്റ്റിവിറ്റി (2628).എൻ-ടെർമിനൽ എൻഎംപിലേഷൻ പ്രോട്ടീൻ അല്ലെങ്കിൽ ആർഎൻഎ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളുമായുള്ള എൻഎസ്‌പി 9-ന്റെ പ്രതിപ്രവർത്തനത്തെയോ അല്ലെങ്കിൽ വ്യത്യസ്ത നാല്-ലെവൽ അസംബ്ലികളുടെ രൂപീകരണത്തെയും ബാധിച്ചേക്കാം.ഇവ ഘടനാപരമായ പഠനങ്ങളിൽ നിരീക്ഷിക്കുകയും കൊറോണ വൈറസ് റെപ്ലിക്കേഷനുമായി പ്രവർത്തനപരമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നതായി സ്ഥിരീകരിക്കുകയും ചെയ്തിട്ടുണ്ട്, പ്രത്യേകിച്ചും ഈ പരിഷ്ക്കരണത്തിന്റെ കാര്യത്തിൽ (26- ââ29, 40).

കൊറോണ വൈറസ് നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ ടാർഗെറ്റ് സവിശേഷത ഇപ്പോഴും കൂടുതൽ വിശദമായി ചിത്രീകരിക്കേണ്ടതുണ്ടെങ്കിലും, കൊറോണ വൈറസ് നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ പ്രോട്ടീൻ ടാർഗെറ്റ് സവിശേഷത വളരെ ഇടുങ്ങിയതാണെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു.എല്ലാ നിഡോവൈറസ് കുടുംബങ്ങളുടെയും നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നിലെ പ്രധാന സജീവമായ സൈറ്റ് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ (8, 16) സംരക്ഷണം ഈ പ്രോട്ടീനുകളുടെ സംരക്ഷിത എൻ‌എം‌പിലേറ്ററിന്റെ പ്രവർത്തനത്തെ ശക്തമായി പിന്തുണയ്ക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, ഈ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ സംരക്ഷണത്തിന്റെയും സംരക്ഷണത്തിന്റെയും അടിവസ്ത്ര ബൈൻഡിംഗ് പോക്കറ്റ് അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ ഐഡന്റിറ്റി സ്വഭാവ സവിശേഷതയാണ്. , കൂടാതെ നിഡോവൈറൽസ് ഉദ്ദേശ്യങ്ങളുടെ വ്യത്യസ്ത കുടുംബങ്ങൾക്കിടയിൽ വ്യത്യാസമുണ്ടാകാം.അതുപോലെ, മറ്റ് നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളുടെ പ്രസക്തമായ ലക്ഷ്യങ്ങൾ ഇനിയും നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടിട്ടില്ല.അവ nsp9-ന്റെയോ മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകളുടെയോ റിമോട്ട് ഓർത്തോലോഗുകളായിരിക്കാം, കാരണം നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകളിൽ പൊതുവെ സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന അഞ്ച് പകർപ്പ് ഡൊമെയ്‌നുകൾക്ക് പുറത്തുള്ള സീക്വൻസുകൾ കുറവ് സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു (8), Mpro-നും NiRAN-നും ഇടയിലുള്ള ജീനോം അറേ ഉൾപ്പെടെ, അവയിൽ, nsp9 സ്ഥിതി ചെയ്യുന്നത് കൊറോണ വൈറസ്.

കൂടാതെ, NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന് അധിക (സെല്ലുലാർ ഉൾപ്പെടെ) ടാർഗെറ്റുകൾ ഉണ്ടായിരിക്കാനുള്ള സാധ്യത ഞങ്ങൾക്ക് നിലവിൽ തള്ളിക്കളയാനാവില്ല.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, ഈ ഉയർന്നുവരുന്ന പ്രോട്ടീൻ NMPylators (NMPylators) (30, 31) ലെ ബാക്ടീരിയൽ ഹോമോലോഗുകൾക്ക് "മാസ്റ്റർ റെഗുലേറ്ററുകൾ" ഉള്ളതായി തോന്നുന്നു എന്നത് എടുത്തുപറയേണ്ടതാണ്?NMP വിവിധതരം സെല്ലുലാർ പ്രോട്ടീനുകളെ അവയുടെ താഴത്തെ പ്രവർത്തനങ്ങളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനോ ഇല്ലാതാക്കുന്നതിനോ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്നു, അതുവഴി സെല്ലുലാർ സ്ട്രെസ് റെസ്പോൺസ്, റെഡോക്സ് ഹോമിയോസ്റ്റാസിസ് (22, 33) പോലെയുള്ള വൈവിധ്യമാർന്ന ജൈവ പ്രക്രിയകളിൽ ഒരു പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.

ഈ പഠനത്തിൽ (ചിത്രങ്ങൾ 2, 4, SI അനുബന്ധം, കണക്കുകൾ S3, S5), nsp12 UMP (NMP) ഭാഗത്തെ nsp9-ൽ ഒരൊറ്റ (സംരക്ഷിത) സ്ഥാനത്തേക്ക് മാറ്റി, മറ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ പരിഷ്കരിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് തെളിയിക്കാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു. വ്യവസ്ഥകളിൽ ഉപയോഗിച്ചു, നന്നായി നിർവചിക്കപ്പെട്ട (അയഞ്ഞതിനുപകരം) അടിവസ്ത്ര സവിശേഷത പിന്തുണയ്ക്കുന്നു.N-ടെർമിനൽ nsp9 NMPylation-മായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, nsp12-ന്റെ സ്വന്തം NMPylation പ്രവർത്തനം വളരെ കുറവാണ്, ഇത് കണ്ടെത്തുന്നതിന് കൂടുതൽ ഓട്ടോറേഡിയോഗ്രാഫി എക്സ്പോഷർ സമയം ആവശ്യമാണ്, കൂടാതെ nsp12 കോൺസൺട്രേഷനിൽ 10 മടങ്ങ് വർദ്ധനവ് ഉപയോഗിക്കുന്നു.കൂടാതെ, ഞങ്ങളുടെ MS വിശകലനം nsp12-ന്റെ NMPylation-ന്റെ തെളിവുകൾ നൽകുന്നതിൽ പരാജയപ്പെട്ടു, NiRAN ഡൊമെയ്ൻ സ്വയം-NMPylation ഒരു ദ്വിതീയ പ്രവർത്തനമാണെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, ബാക്ടീരിയൽ എൻഎംപിലേറ്ററിന്റെ സ്വയം-എഎംപിലേഷൻ നില മറ്റ് പ്രോട്ടീൻ സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകളിൽ (22, 33) അവയുടെ എൻഎംപിലേഷൻ പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുമെന്നതിന് മറ്റ് പഠനങ്ങൾ പ്രാഥമിക തെളിവുകൾ നൽകിയിട്ടുണ്ട് എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.അതിനാൽ, EAV nsp9 (16), കൊറോണ വൈറസ് nsp12 (ഈ പഠനം) എന്നിവയ്‌ക്കായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്‌ത സ്വയം-NMPylation പ്രവർത്തനങ്ങളുടെ സാധ്യമായ പ്രവർത്തനപരമായ ഫലങ്ങളെക്കുറിച്ച് അന്വേഷിക്കാൻ കൂടുതൽ ഗവേഷണം ആവശ്യമാണ്, C-ടെർമിനൽ RdRp ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (C-ടെർമിനൽ RdRp ഡൊമെയ്‌നിന്റെ (16) ഫോൾഡിംഗിൽ നിർദ്ദേശിച്ച ചാപ്പറോൺ പോലെയുള്ള പ്രഭാവം ഉൾപ്പെടെ. 16)).

മുമ്പ്, നിഡോവൈറൽ നിറാൻ ഡൊമെയ്‌നിന്റെ സാധ്യമായ ഡൗൺസ്‌ട്രീം ഫംഗ്‌ഷനുകളെക്കുറിച്ചുള്ള നിരവധി അനുമാനങ്ങൾ പരിഗണിച്ചിരുന്നു, അവയിൽ ആർഎൻഎ ലിഗേസ്, ആർഎൻഎ-ക്യാപ്പ്ഡ് ഗ്വാനൈലേറ്റ് ട്രാൻസ്‌ഫറസ്, പ്രോട്ടീൻ പ്രൈമിംഗ് ആക്‌റ്റിവിറ്റി (16) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു, എന്നാൽ അവയൊന്നും ലഭ്യമായ ഡൗൺസ്‌ട്രീം ഫംഗ്‌ഷനുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല.ഇനിപ്പറയുന്ന സ്ഥാനങ്ങളിൽ ലഭിച്ച വിവരങ്ങൾ അധിക അനുമാനങ്ങളില്ലാതെ കൃത്യമായി ഒരേ സമയമാണ്.ഈ പഠനത്തിൽ ലഭിച്ച ഡാറ്റ പ്രോട്ടീൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ആർഎൻഎ സിന്തസിസ് ആരംഭിക്കുന്നതിൽ NiRAN ഡൊമെയ്ൻ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു എന്നതിന് ഏറ്റവും സ്ഥിരതയുള്ളതാണ് (എന്നാൽ തെളിയിക്കാൻ കഴിയില്ല).NiRAN ഡൊമെയ്‌നിന്റെ പ്രവർത്തനം 5 ൽ ആണെന്ന് മുമ്പ് വിശ്വസിച്ചിരുന്നു.²-RNA ക്യാപ്പിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ RNA ലിഗേഷൻ പ്രതികരണങ്ങൾ ഇവയും മറ്റ് ഡാറ്റയുടെ പിന്തുണയും ബാധിക്കില്ല.അതിനാൽ, ഉദാഹരണത്തിന്, NiRAN-ന്റെ സജീവ സൈറ്റ് ഒരു പൊതു അടിത്തറയായി സംരക്ഷിത Asp ഉൾപ്പെടുന്നതായി കണക്കാക്കുന്നു (സ്യൂഡോമോണസ് സിറിംഗേ SelO-യിൽ D252; HCoV-229E pp1ab-ൽ D4271; SARS-CoV-2 nsp12-ൽ D208) (SI അനുബന്ധം 2, ചിത്രം 2 ).S2) (17, 22, 33), അതേസമയം എടിപി-ആശ്രിത ആർഎൻഎ ലിഗേസിലും ആർഎൻഎ ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈമിലുമുള്ള കാറ്റലിസിസ് കോവാലന്റ് എൻസൈം-(ലൈസിൽ-എൻ)-എൻഎംപി ഇന്റർമീഡിയറ്റ് ആണ് നടത്തുന്നത്, ഇതിൽ മാറ്റമില്ലാത്ത ലൈസ് അവശിഷ്ടം ഉൾപ്പെടുന്നു ( 41).കൂടാതെ, സംരക്ഷിത പ്രോട്ടീൻ ടാർഗെറ്റുകൾക്കായുള്ള കൊറോണ വൈറസ് NiRAN-ന്റെ ശ്രദ്ധേയമായ സീക്വൻസ് അധിഷ്ഠിത പ്രത്യേകതയും NTP കോ-സബ്‌സ്‌ട്രേറ്റുകൾക്കുള്ള (UTP മുൻഗണന നൽകുന്നു) അയഞ്ഞ പ്രത്യേകതയും NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് ക്യാപ്പിംഗ് എൻസൈമിനെ അല്ലെങ്കിൽ RNA ലിഗേസ് പോലുള്ള പ്രവർത്തനങ്ങളെ എതിർക്കുന്നു.

വ്യക്തമായും, പ്രോട്ടീൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ആർ‌എൻ‌എ സിന്തസിസിൽ nsp9-UMP (nsp9-NMP) യുടെ സാധ്യമായ പങ്ക് പരിശോധിക്കാനും തെളിയിക്കപ്പെട്ടാൽ വിശദീകരിക്കാനും ധാരാളം അധിക ജോലികൾ ആവശ്യമാണ്, ഇത് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്ത നിരവധി രസകരമായ എന്നാൽ (ഇതുവരെ) റിപ്പോർട്ടുകളെ ബന്ധിപ്പിക്കും. .ഒറ്റപ്പെട്ട നിരീക്ഷണങ്ങൾ.ഉദാഹരണത്തിന്, കൊറോണ വൈറസിന്റെ നെഗറ്റീവ് സ്‌ട്രാൻഡ് ആർഎൻഎയുടെ അവസാനം ഒരു ഒലിഗോ(യു) സ്‌ട്രാൻഡ് (42, 43) ഉപയോഗിച്ചാണ് ആരംഭിക്കുന്നതെന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്.nsp9-ന്റെ UMPylated രൂപത്തെ പോളി(A) വാലിലേക്ക് (ട്രിഗറുകൾ) ബന്ധിപ്പിച്ചാണ് നെഗറ്റീവ്-സ്ട്രാൻഡ് RNA-യുടെ സമന്വയം ആരംഭിക്കുന്നത് എന്ന ആശയവുമായി ഈ നിരീക്ഷണം പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, അത് അതിന്റെ RNA ബൈൻഡിംഗ് വഴി പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കപ്പെടാം. മറ്റൊരു RTC പ്രോട്ടീൻ.nsp9 നൽകുന്ന UMP ഭാഗം പിന്നീട് nsp7/8/nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് ഒലിഗൂറിഡൈലേഷനായി ഒരു "പ്രൈമർ" ആയി ഉപയോഗിക്കാം, ജീനോമിക് RNA-യിലെ 3??²-poly(A) ടെയിൽ അല്ലെങ്കിൽ മറ്റൊരു ഒളിഗോ (A)-അടങ്ങുന്ന ക്രമം. picornavirus VPg പ്രോട്ടീന് (44) സ്ഥാപിച്ച മെക്കാനിസത്തിന് സമാനമായ ഒരു ടെംപ്ലേറ്റായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു.നിർദ്ദേശം "നിയമമല്ല" ആണെങ്കിലോ????(പ്രോട്ടീൻ-ഇൻഡ്യൂസ്‌ഡ്) നെഗറ്റീവ് സ്‌ട്രാൻഡ് ആർഎൻഎ സിന്തസിസിന്റെ തുടക്കം നിരീക്ഷണങ്ങളിലേക്ക് ഒരു ലിങ്ക് നൽകുന്നു, കൊറോണ വൈറസ് നെഗറ്റീവ് സ്‌ട്രാൻഡ് ആർഎൻഎയുടെ അവസാനത്തിൽ യുഎംപി (യുടിപിക്ക് പകരം) ഉണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (42), ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നതായി കണക്കാക്കുന്നു. ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഡൈസർ അജ്ഞാതമായ യൂറിഡിൻ-നിർദ്ദിഷ്ട എൻഡോ ന്യൂക്ലീസ് ഉപയോഗിച്ച് ഫോസ്ഫോറിലേറ്റ് ചെയ്ത അറ്റത്തെ പിളർത്തുന്നു.സ്ഥിരീകരിക്കപ്പെട്ടാൽ, ഈ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ഹൈഡ്രോലൈറ്റിക് പ്രവർത്തനം നാസന്റ് നെഗറ്റീവ് സ്ട്രാൻഡിന്റെ 5² അറ്റത്ത് നിന്ന് nsp9 ന്റെ ഒളിഗോമെറിക് UMPylated രൂപത്തെ പുറത്തുവിടാൻ സഹായിക്കും.പ്രോട്ടീൻ പ്രൈമിംഗിൽ nsp9 ന്റെ സാധ്യമായ പങ്ക് മുൻ വിപരീത ജനിതക പഠനങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, കൊറോണ വൈറസ് ജീനോമിന്റെ 3 അറ്റത്തിനടുത്തുള്ള സംരക്ഷിത സിസ്-ആക്ടിംഗ് RNA മൂലകവുമായി nsp9 (ഒപ്പം nsp8) വിമർശനാത്മകമായും പ്രത്യേകമായും ഇടപഴകുന്നുവെന്ന് കാണിക്കുന്നു.45).ഈ റിപ്പോർട്ട് അനുസരിച്ച്, ഈ മുൻ നിരീക്ഷണങ്ങൾ ഇപ്പോൾ വീണ്ടും പരിശോധിക്കാനും കൂടുതൽ ഗവേഷണത്തിലൂടെ വിപുലീകരിക്കാനും കഴിയും.

ചുരുക്കത്തിൽ, N-ടെർമിനസിലെ RdRp-യുമായി ബന്ധിപ്പിച്ചിട്ടുള്ള ഒരു കുത്തക നെസ്റ്റഡ് വൈറസ് എൻസൈം ടാഗിന്റെ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തനം ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ നിർണ്ണയിച്ചു.കൊറോണ വൈറസിൽ, പുതുതായി കണ്ടെത്തിയ ഈ NiRAN-മെഡിയേറ്റഡ് UMPylator/NMPylator പ്രവർത്തനം Mn2+, അതിനടുത്തുള്ള Asn അവശിഷ്ടങ്ങൾ എന്നിവയെ ആശ്രയിക്കാനും N-ടെർമിനൽ പ്രൈമറി അമീനുമായി (കുറഞ്ഞ ഊർജ്ജം) ഫോസ്ഫോറാമിഡേറ്റ് ബോണ്ടുകളുടെ രൂപീകരണത്തിനും കാരണമാകുന്നു.nsp8|9 cleavage സൈറ്റിലെ Mpro-mediated cleavage വഴി, NMP9 ടാർഗെറ്റ് NMPylation-നായി ഉപയോഗിക്കാം, ഇത് RdRp വരെ നീളുന്ന പ്രോട്ടീസും NiRAN ഡൊമെയ്‌നും തമ്മിലുള്ള പ്രവർത്തനപരമായ കപ്ലിംഗിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.nsp12 NiRAN ആക്റ്റീവ് സൈറ്റിലെ പ്രധാന അവശിഷ്ടങ്ങളുടെ സംരക്ഷണവും nsp9 ടാർഗെറ്റും, SARS-CoV-2 ഉൾപ്പെടെയുള്ള രണ്ട് കൊറോണ വൈറസുകളിൽ നിന്ന് ലഭിച്ച ഡാറ്റയും സംയോജിപ്പിച്ച്, nsp9 NMPylation ഒരു കൊറോണ വൈറസ് ആണെന്നതിന് ശക്തമായ തെളിവ് നൽകുന്നു കൺസർവേറ്റീവ് ഫീച്ചറുകളും വൈറസ് പകർപ്പെടുക്കലിലെ ഒരു പ്രധാന ഘട്ടമാണ്.പ്രോട്ടീൻ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ആർ‌എൻ‌എ സിന്തസിസിൽ എൻ‌എം‌പി 9 ന്റെ എൻ‌എം‌പി‌ലേറ്റഡ് രൂപത്തിന്റെ പ്രത്യേക പങ്ക് കൊറോണ വൈറസിനും മറ്റ് നെസ്റ്റഡ് വൈറസുകൾ‌ക്കും ന്യായമായ ഒരു സാഹചര്യമാണെന്നും നിറാൻ മറ്റ് അജ്ഞാത പ്രോട്ടീനുകളെയും ലക്ഷ്യം വച്ചേക്കാമെന്നും ലഭ്യമായ ഡാറ്റ നിഗമനം ചെയ്യുന്നു.വൈറസ് നിയന്ത്രിക്കുക.ഹോസ്റ്റ് ഇടപെടൽ.സ്ഥിരീകരിച്ചാൽ, വൈറൽ ആർഎൻഎ സിന്തസിസിൽ പ്രോട്ടീൻ പ്രൈമറുകളുടെ പങ്കാളിത്തം, മുമ്പ് കണ്ടെത്തിയ കൊറോണ വൈറസിനും പിക്കോർണവൈറസ് പോലുള്ള സൂപ്പർഗ്രൂപ്പിനും (9) ഇടയിലുള്ള Mpro/3CLpro, RdRp ഡൊമെയ്‌നുകളുടെ സീക്വൻസ് അഫിനിറ്റി വർദ്ധിപ്പിക്കും. 46) വിഭാഗത്തിൽ.

ഈ പഠനത്തിൽ തിരിച്ചറിഞ്ഞ അടിസ്ഥാനപരവും തിരഞ്ഞെടുത്തതും യാഥാസ്ഥിതികവുമായ എൻസൈം പ്രവർത്തനങ്ങൾ ആൻറിവൈറൽ മരുന്നുകളുടെ ലക്ഷ്യമായി ഉപയോഗിക്കാമെന്നും ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ കാണിക്കുന്നു.NiRAN-ന്റെ സജീവ സൈറ്റിലെ സംരക്ഷിത nsp9 N- ടെർമിനസിന്റെ ബൈൻഡിംഗിനെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന (തുടർന്നുള്ള പരിഷ്‌ക്കരണവും) സംയുക്തങ്ങളെ, വ്യത്യസ്ത (ഉപ) ജനുസ് അണുബാധകളിൽ നിന്നുള്ള മൃഗങ്ങളുടെയും മനുഷ്യരുടെയും കൊറോണ വൈറസുകളുടെ ചികിത്സയ്ക്ക് അനുയോജ്യമായ, ഫലപ്രദവും ബഹുമുഖവുമായ ആൻറിവൈറൽ മരുന്നുകളായി വികസിപ്പിക്കാൻ കഴിയും. SARS-CoV-2, മിഡിൽ ഈസ്റ്റ് റെസ്പിറേറ്ററി സിൻഡ്രോം കൊറോണ വൈറസ് എന്നിവയുൾപ്പെടെ.

ഈ പഠനത്തിൽ ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ച കൊറോണ വൈറസ് പ്രോട്ടീന്റെ കോഡിംഗ് ക്രമം RT-PCR ഉപയോഗിച്ച് HCoV-229E അല്ലെങ്കിൽ SARS-CoV-2 ബാധിച്ച Vero E6 ബാധിച്ച Huh-7 ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത RNA ഉപയോഗിച്ച് വർദ്ധിപ്പിച്ച് സാധാരണ ക്ലോണിംഗ് നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ചേർത്തു.pMAL-c2 (ന്യൂ ഇംഗ്ലണ്ട് ബയോളജിക്കൽ ലബോറട്ടറി) അല്ലെങ്കിൽ pASK3-Ub-CHis6 (47) എക്സ്പ്രഷൻ വെക്റ്റർ (SI അനുബന്ധം, പട്ടികകൾ S1, S2).പിസിആർ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള സൈറ്റ്-ഡയറക്ടഡ് മ്യൂട്ടജെനിസിസ് (48) ആണ് സിംഗിൾ കോഡൺ സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂഷനുകൾ അവതരിപ്പിച്ചത്.MBP ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന്, E. coli TB1 സെല്ലുകൾ ഉചിതമായ pMAL-c2 പ്ലാസ്മിഡ് കൺസ്ട്രക്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് രൂപാന്തരപ്പെടുത്തി (SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1).അമൈലോസ് അഫിനിറ്റി ക്രോമാറ്റോഗ്രഫി ഉപയോഗിച്ച് ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ ശുദ്ധീകരിക്കുകയും ഫാക്ടർ Xa ഉപയോഗിച്ച് പിളർക്കുകയും ചെയ്തു.തുടർന്ന്, C-ടെർമിനൽ His6-ടാഗുചെയ്‌ത പ്രോട്ടീൻ മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) വഴി ശുദ്ധീകരിക്കപ്പെട്ടു (49).ubiquitin ഫ്യൂഷൻ പ്രോട്ടീൻ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന്, E. coli TB1 സെല്ലുകൾ ഉചിതമായ pASK3-Ub-CHis6 പ്ലാസ്മിഡ് നിർമ്മിതിയും (SI അനുബന്ധം, പട്ടികകൾ S1, S2) pCGI പ്ലാസ്മിഡ് DNA എൻകോഡിംഗ് ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1) എന്നിവയും ഉപയോഗിച്ചു.രൂപാന്തരം (47).C-ടെർമിനൽ His6-ടാഗ് ചെയ്ത കൊറോണ വൈറസ് പ്രോട്ടീൻ മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ശുദ്ധീകരിച്ചു (50).

HCoV-229E nsp12-His6-ന്റെ സ്വയം-NMPylation ടെസ്റ്റ് EAV nsp9 (16)-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ നടത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, nsp12-His6 (0.5 µM) ൽ 50 mM 4-(2-ഹൈഡ്രോക്സിതൈൽ)-1-piperazinethanesulfonic ആസിഡ് (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffate inc25 അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു. നിർദ്ദിഷ്‌ട NTP-യും 0.17 µM-ഉം [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; ഹാർട്ട്മാൻ അനലിറ്റിക്) 30 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 30 മിനിറ്റ് പൊരുത്തപ്പെട്ടു.nsp12-മെഡിയേറ്റഡ് nsp9 NMPylation-ന്റെ മറ്റെല്ലാ (സ്റ്റാൻഡേർഡ്) NMPylation പരിശോധനകളിലും, പ്രതികരണ വ്യവസ്ഥകൾ ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ ക്രമീകരിച്ചിരിക്കുന്നു: nsp12-His6 (0.05 µM), nsp9-His6 (4 µM) എന്നിവ 50 mM HEPES-KOH (HepH-KOH) സാന്നിധ്യത്തിൽ. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM സൂചിപ്പിച്ച NTP, 0.17 µM പൊരുത്തപ്പെടുന്നു [α32-P]NTP.30 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 10 മിനിറ്റ് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത ശേഷം, പ്രതികരണ സാമ്പിൾ എസ്ഡിഎസ്-പേജ് സാമ്പിൾ ബഫറുമായി കലർത്തി: 62.5 എംഎം ട്രൈസ് (ഹൈഡ്രോക്സിമീഥൈൽ) അമിനോമെഥെയ്ൻ എച്ച്സിഎൽ (പിഎച്ച് 6.8), 100 എംഎം ഡിടിടി, 2.5% എസ്ഡിഎസ്, 10% ഗ്ലിസറോൾ, ബ്രോംഫെൻറോൾ, 0.005% നീല.5 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ചൂടാക്കി പ്രോട്ടീൻ ഡിനേച്ചർ ചെയ്യുകയും 12% SDS-PAGE കൊണ്ട് വേർതിരിക്കുകയും ചെയ്തു.Coomassie Brilliant Blue ലായനി (40% മെഥനോൾ, 10% അസറ്റിക് ആസിഡ്, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) ഉപയോഗിച്ച് ജെൽ ഉറപ്പിക്കുകയും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നു, നിറം മാറ്റുകയും 20 മണിക്കൂർ ഫോസ്‌ഫോറസെന്റ് ഇമേജിംഗ് സ്ക്രീനിൽ തുറന്നുകാട്ടുകയും ചെയ്യുന്നു (NMP12-ൽ നിന്ന് nsp12 കണ്ടെത്തുന്നതിന്) അല്ലെങ്കിൽ (പരമാവധി) 2 മണിക്കൂർ (nsp9 NMPylation വിലയിരുത്താൻ).സ്‌ക്രീൻ സ്കാൻ ചെയ്യാൻ ടൈഫൂൺ 9200 ഇമേജർ (ജിഇ ഹെൽത്ത് കെയർ) ഉപയോഗിച്ചു, സിഗ്നൽ തീവ്രത വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഇമേജ് ജെ ഉപയോഗിച്ചു.

MS വിശകലനത്തിനായി, NMPylation വിശകലനത്തിൽ (SI അനുബന്ധം, പട്ടിക S1) 1 µM nsp12-His6, 10 µM nsp9 (ഹെക്സാഹിസ്റ്റിഡിൻ ടാഗ് ഇല്ലാതെ) ഉപയോഗിച്ചു, കൂടാതെ 500 µM UTP, GTP എന്നിവയുടെ വർദ്ധിച്ച സാന്ദ്രതയും ഉപയോഗിച്ചു.അവയുടെ ഏകാഗ്രതയും പ്രതീക്ഷിക്കുന്ന പ്രോട്ടീൻ ഗുണനിലവാരവും അനുസരിച്ച്, 1 മുതൽ 10 µL വരെ ബഫർ ചെയ്ത പ്രോട്ടീൻ ലായനികൾ ഓൺലൈനിൽ ഡീസാൾട്ട് ചെയ്യാൻ മാസ്‌പ്രെപ്പ് കോളം (വാട്ടേഴ്‌സ്) ഘടിപ്പിച്ച വാട്ടർസ് അക്വിറ്റി എച്ച്-ക്ലാസ് എച്ച്പിഎൽസി സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ചു.താഴെ പറയുന്ന ബഫർ എ (വെള്ളം/0.05% ഫോർമിക് ആസിഡ്), ബഫർ ബി (അസെറ്റോണിട്രൈൽ/0.045% ഫോർമിക് ആസിഡ്) എന്നിവയുടെ ഗ്രേഡിയന്റിലൂടെ സിനാപ്റ്റ് ജി2എസ്ഐ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിന്റെ (വാട്ടേഴ്സ്) ഇലക്ട്രോസ്പ്രേ അയോൺ സ്രോതസ്സിലേക്ക് ഡിസാൽറ്റഡ് പ്രോട്ടീൻ എലീറ്റ് ചെയ്യപ്പെടുന്നു. 60 ° C, 0.1 മില്ലി/മിനിറ്റ് ഫ്ലോ റേറ്റ്: 2 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 5% A ഉപയോഗിച്ച് ഐസോക്രാറ്റിക്കലായി എല്യൂഷൻ, തുടർന്ന് 8 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 95% B ലേക്ക് ഒരു ലീനിയർ ഗ്രേഡിയന്റ്, മറ്റൊരു 4 മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് 95% B നിലനിർത്തുക.

500 മുതൽ 5000 m/z വരെ പിണ്ഡമുള്ള പോസിറ്റീവ് അയോണുകൾ കണ്ടെത്തി.ഓട്ടോമാറ്റിക് മാസ് ഡ്രിഫ്റ്റ് തിരുത്തലിനായി ഗ്ലൂ-ഫൈബ്രിനോപെപ്റ്റൈഡ് ബി ഓരോ 45 സെക്കൻഡിലും അളക്കുന്നു.ബേസ്‌ലൈൻ കിഴിച്ച് മിനുസപ്പെടുത്തിയ ശേഷം ശരാശരി സ്പെക്‌ട്രം ഡീകോൺവോൾവ് ചെയ്യാൻ MaxEnt1 വിപുലീകരണത്തോടുകൂടിയ MassLynx ഇൻസ്ട്രുമെന്റ് സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിക്കുക.

UMPylated HCoV-229E nsp9 സീക്വൻസിംഗ്-ഗ്രേഡ് പരിഷ്കരിച്ച ട്രിപ്സിൻ (സെർവ) ചേർത്ത് ദഹിപ്പിക്കുകയും 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.ഒരു ക്രോമബോണ്ട് C18WP സ്പിൻ കോളം (ഭാഗം നമ്പർ 730522; മച്ചേരി-നാഗൽ) പെപ്റ്റൈഡുകളെ ഡീസാൾട്ട് ചെയ്യാനും കേന്ദ്രീകരിക്കാനും ഉപയോഗിച്ചു.അവസാനം, പെപ്റ്റൈഡ് 25 µL വെള്ളത്തിൽ ലയിച്ചു, അതിൽ 5% അസെറ്റോണിട്രൈലും 0.1% ഫോർമിക് ആസിഡും അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു.

ഓർബിട്രാപ്പ് വെലോസ് പ്രോ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്റർ (തെർമോ സയന്റിഫിക്) ഉപയോഗിച്ച് സാമ്പിളുകൾ എംഎസ് വിശകലനം ചെയ്തു.ആത്യന്തിക നാനോ HPLC സിസ്റ്റം (Dionex), ഒരു കസ്റ്റം എൻഡ്-മൌണ്ട് ചെയ്ത 50 സെ.മീ ??75 μm C18 RP കോളം 2.4 μm കാന്തിക മുത്തുകൾ (ഡോ. ആൽബിൻ മൈഷ് ഹൈ പെർഫോമൻസ് LC GmbH) പ്രോക്സിയോൺ നാനോസ്പ്രേ ഉറവിടം വഴി ഓൺലൈനിൽ മാസ് സ്പെക്ട്രോമീറ്ററിലേക്ക് കണക്റ്റുചെയ്യുക;300 µm അകത്തെ വ്യാസത്തിലേക്ക് 6 µL ട്രൈപ്സിൻ ദഹന ലായനി കുത്തിവയ്ക്കുക ×??1 സെ.മീ C18 PepMap പ്രീ-കോൺസൻട്രേഷൻ കോളം (തെർമോ സയന്റിഫിക്).ലായകമായി വെള്ളം/0.05% ഫോർമിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച്, സാമ്പിൾ സ്വയമേവ കുടുങ്ങി 6 µL/min എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ ഡീസാലിനേറ്റ് ചെയ്തു.

300 nL/min എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ ട്രിപ്‌റ്റിക് പെപ്റ്റൈഡുകളെ വേർപെടുത്താൻ വെള്ളം/0.05% ഫോർമിക് ആസിഡ് (ലായനി എ), 80% അസെറ്റോണിട്രൈൽ/0.045% ഫോർമിക് ആസിഡ് (ലായനി ബി) എന്നിവയുടെ ഇനിപ്പറയുന്ന ഗ്രേഡിയന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു: 4% B 5 മിനിറ്റ്, തുടർന്ന് 30 A ലീനിയർ ഗ്രേഡിയന്റ് മിനിറ്റുകൾക്കുള്ളിൽ 45% B ലേക്ക്, 5 മിനിറ്റിനുള്ളിൽ 95% സോൾവെന്റ് B ആയി ലീനിയർ വർദ്ധനവ്.ക്രോമാറ്റോഗ്രാഫിക് കോളം ഒരു സ്റ്റെയിൻലെസ്സ് സ്റ്റീൽ നാനോ-എമിറ്ററുമായി (പ്രോക്‌സിയോൺ) ബന്ധിപ്പിക്കുക, കൂടാതെ 2,300 V ന്റെ പൊട്ടൻഷ്യൽ ഉപയോഗിച്ച് മാസ് സ്പെക്‌ട്രോമീറ്ററിന്റെ ചൂടായ കാപ്പിലറിയിലേക്ക് എല്യൂവെന്റ് നേരിട്ട് സ്‌പ്രേ ചെയ്യുക. ഓർബിട്രാപ്പ് മാസ് അനലൈസറിൽ 60,000 റെസല്യൂഷനുള്ള സർവേ സ്കാൻ ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ലീനിയർ അയോൺ ട്രാപ്പ് കൊളിഷൻ ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഡിസോസിയേഷൻ അല്ലെങ്കിൽ ഓർബിട്രാപ്പ് ഡിറ്റക്ഷനുമായി സംയോജിപ്പിച്ച ഉയർന്ന ഊർജ്ജ കൂട്ടിയിടി വിച്ഛേദനം എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് 30 സെക്കൻഡ് നേരത്തേക്ക് ചലനാത്മകമായി ഒഴിവാക്കിയ മൂന്ന് ഡാറ്റ MS/MS സ്‌കാനുകൾക്കൊപ്പം, റെസല്യൂഷൻ 7,500 ആണ്.